Методи культивування бактерій і визначення її кількості у досліджуваному матеріалі. Поживні середовища та їх класифікація. Типи і механізм живлення і дихання бактерій. Методи створення анаеробних умов.

Вплив факторів зовнішнього середовища на мікроорганізми. Методи стерилізації і дезинфекції.. Асептика та антисептика. Особливості стерилізації стоматологічного інструментарію. Методи контролю.

Вчення про генетику мікроорганізмів.

 

 

Культивування мікроорганізмів. Для вирощування бактерій в лабораторних умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища.  Вони повинні відповідати певним стандартам, створюючи оптимальні умови  для росту, розмноження й життєдіяльності мікроорганізмів.

В першу чергу бактерії потребують азоту, вуглецю  та водню для побудови власних білків. Водень і кисень  для клітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, тваринного походження (мясо яловиче, риба, мясо-кісткова мука, казеїн), а також  білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використовувати й замінники мяса - плаценту, кровяні згустки, дріжджі. Отже, до складу  середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і води, а також ростові фактори (вітаміни, ферменти). Універсальним джерелом їх служать екстракти з білків тваринного  й рослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати - кров, сироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, кусочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін.

Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію,  мати у своєму складі неорганічні фосфати.

Допустимим є вживання речовин, які усувають дію інгібіторів росту і токсиноутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його високої буферності. Середовища повинні мати певну вязкість, густину Залежно (рідкі, напіврідкі, щільні), бути ізотонічними, прозорими й обовязково стерильними.

Численні потреби мікроорганізмів зумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існують  спеціальні середовища. Частину їх готують у  лабораторіях безпосередньо перед посівом, але з кожним роком зявляються все нові й нові середовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовільнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад.

 

Класифікація живильних середовищ

П р о с т і

С к л а д н і

Рідкі: ПВ, МПБ

Щільні: МПЖ, МПА

  Спеціальні: цукров. МПА, МПБ, сиров. МПА,                    кров. МПА, асцит. МПА

  Збагачення, накопичення: селенітовий МПБ,

    с-ща Мюллера, Кауффмана, Кітт-Тароцці

  Елективні: Ру, 1% лужна ПВ

              Диференціально-діагностичні:

  1.для визначення цукролітичних властивостей

              (с-ща Гіса, Ендо, Левіна, Плоскірева)

  2. для визначення протеолітичних властивостей

     (згорнута сироватка, МПЖ, кусочки м’язів)

  3. для визначення пептолітичних властивостей

                          (МПБ, ПВ)

  4. для визначення гемолітичних властивостей

                   (кров. МПА)

  5. для визначення редукуючих властивостей

     (середовища з різними барвниками)

 

Залежно від своєї густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкі та щільні. Напіврідкі та щільні середовища готуються з рідких, додаючи відповідно 0,3-0,7 %  та 1,5-2,0 % агару. Останній представляє собою  волокнистий матеріал, який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %), білків (2-3 %), основними складниками є високомолекулярні агароза та агаропептин.  Агар розчиняється у воді при підвищеній температурі, а, застигаючи,  надає  середовищу драглеподібної консистенції та стійкості до ферментних  систем бактерій. Саме за ці властивості він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ   використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові.

Середовища поділяються на природні й штучні. Як природні використовують згорнуту сироватку, молоко, яйця, мязову тканину. Штучні середовища створюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів.

Залежно від потреб бактеріологів існуючі живильні середовища поділяються на чотири основні групи.

Перша група - універсальні (прості) середовища. До них належать прості середовища: мясо-пептонний бульйон (МПБ) та мясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наявністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Escherichia%20coli

МПА

 

Друга група - спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кровяний,  сироватковий агари,  сироватковий бульйон, асцитичний бульйон та асцит-агар.

Описание: Описание: Описание: Описание: coc22

Кров’яний агар

 

Третя група - елективні середовища. Їх використовують для цілеспрямованого виділення та накопичення бактерій з матеріалу, який містить багато сторонніх мікробів.  Створюючи такі середовища, враховують біологічні особливості бактерій певного виду, які відрізняють їх від інших. Наприклад, елективним для холерних вібріонів є 1 % лужна пептонна вода, середовища Ру та Леффлера - для збудників дифтерії, середовище Плоскірева - для дизентерійних паличок, середовище Мюллера- для тифо-паратифозних бактерій. Гарний ріст стафілококів спостерігаєтся на  середовищах, у складі яких є  до 10 % хлориду натрію. Мікрококи та коринебактерії ростуть на агарі, що містить фуразолідон.

Додавання антибіотиків до складу живильних середовищ робить їх елективними відносно антибіотикостійких штамів.

Четверта група - диференціально-діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх первинну диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей тощо.

 

Описание: Описание: Описание: Описание: ent04

Середовище Ендо.

 

 

Описание: Описание: Описание: Описание: M_BI_SL_16small

Середовище Левіна

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Reactions of <i>Bacillus</i> in glucose fermentation broth

Середовища Гіса

 

На поверхні щільного поживного середовища мікрорганізми можуть утворювати суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія -  це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Утворення її є проявом  культуральних властивостей бактерій.

Характеристика колоній - важлива складова частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду  притаманні свої особливі  колонії.

Описание: Колония

 

Описание: Види_поверх

 

Характеризувати колонії можна за різними ознаками. За величиною (діаметром) вони поділяються на великі (4-6 мм і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1-  2 мм), карликові або точкові (менше 1 мм). Форма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, неправильна (амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають прозорими, що пропускають світло, і мутними.

За рельєфом  і контуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяються на плоскі, опуклі, куполоподібні, каплеподібні, конусоподібні. плоскоопуклі, плоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска серединою.

Описание: Описание: Описание: Описание: R_19_types_colony

Різні види колоній

 

Поверхню колоній вивчають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи чи малого збільшення мікроскопа. Вона може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми (smooth - гладенький), а шорсткі -  R-форми (rough - шорсткий, нерівний).

Форма шорстких поверхонь також може бути різноманітною: зморшкуватою, гірозною, бородавчастою, шагреневою, мати радіальну посмугованість  тощо.

Переважна більшість мікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак деякі з них  формують кольорові колонії. Їх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.

Структуру колоній досліджують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні і чи волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.  

При доторканні до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пастоподібна, вязка або слизова, суха, крихка тощо.

На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному. хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.

Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому може не  змінюватись або набуває кольору пігменту. Такий характер росту найчастіше спостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів.

Деколи відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може бути крихтоподібним, гомогенним, вязким, слизистим та ін. Середовище над ним може залишатись прозорим або ставати мутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад  має сірувато-білий або жовтуватий колір. Подібним чином ростуть,  як правило, анаеробні бактерії.

Пристінковий ріст проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим.

Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати вязку, слизову консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами.

 

ТИПИ І МЕХАНІЗМИ ЖИВЛЕННЯ БАКТЕРІЙ

Фізіологія мікроорганізмів вивчає біохімічні й енергетичні процеси, що відбуваються в бактеріальній клітині й забезпечують відтворення її структурного матеріалу та енергетичні потреби.

Бактерії є складними живими організмами, в яких відбуваються  різноманітні біохімічні перетворення. Вони зумовлюють ріст, розмноження, продукцію ферментів, токсинів та інших біологічно активних речовин, відповідають за регуляцію  функціональної активності клітин, їх високу пластичність і здатність адаптуватись до умов зовнішнього середовища.

Хімічний склад бактерій. Як і всі живі  істоти, бактерійна клітина складається з чотирьох основних елементів - азоту, вуглецю, водню, кисню. Вуглець складає 45-   55 % сухого залишку клітини, кисень - 25-30 %, азот - 8-15 % і водень - 6-8 %. Ці органогени служать матеріалом, з якого побудовано всі складові компоненти клітини: нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди, вуглеводи, численні ферментні системи тощо.

Залежно від виду бактерії містять від 70 до 90 % води. Вона може знаходитись у вільному (в цитоплазмі) або звязаному стані. Вільна вода є середовищем, в якому відбувається  розмаїття біохімічних перетворень (розщеплення й синтез речовин) внаслідок дії гідролітичних ферментів, в ній спостерігається рух іонів, вона виступає розчинником  багатьох речовин, що надходять у клітину, забезпечує колоїдний стан цитоплазми.

Звязана вода - також необхідний компонет цитоплазми, проте вона не може служити розчинником. Втрата води клітиною призводить до її загибелі. Якщо бактерію помістити в гіпертонічний розчин, вода починає виходити  з неї, цитоплазма зморщується, відшаровується від стінки, набуває вигляду дрібної грудочки, а клітина гине.

Сухий залишок становить 10-30 %. Він формується  з білків, нуклеїнових кислот, ліпідів, вуглеводів, полісахаридів, низькомолекулярних органічних речовин і солей.

У  клітині нараховується понад 2,4 млн різноманітних білкових молекул 1850 видів

 

Хімічний склад клітини

Білок

55 %

2,4 млн. мол

РНК

20,5%

250 тис. мол.

ДНК

3,1 %

2 молекули

Ліпіди

9,1 %

22 млн. молекул

Ліпополісахариди

3,4 %

1,5 млн. молекул

Пептидоглікан

2,5 %

1 молекула

 

Білок складає до 55 % сухого залишку клітини. Його представлено простими та складними білками. Прості білки  називають протеїнами. За своїм складом вони суттєво не відрізняються від білків еукаріотичних організмів. Основна їх маса міститься в цитоплазмі клітини, цитоплазматичній мембрані, клітинній стінці грамнегативних  мікробів, нуклеоїді. Токсини збудників газової анаеробної інфекції, правця, ботулізму, фермент гіалуронідаза є простими білками.

Складні білки - протеїди свою назву отримали за здатність сполучатися з іншими речовинами. Так, білки, звязані  з нуклеїновими кислотами, одержали назву нуклеопротеїди, з вуглеводами - глікопротеїди, ліпідами - ліпопротеїди, залізом, міддю-  хромопротеїди. Вони відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини. Так, нуклеопротеїди забезпечують суперспіралізацію нуклеїнових кислот; глікопротеїди входять до складу клітинної стінки, капсули й виконують захисну функцію, забезпечують особливості будови клітинних антигенів; ліпопротеїди зумовлюють токсичні властивості бактеріальних ендотоксинів, отже, вірулентність мікробів; хромопротеїди відповідають за дихальну  функцію клітини, є переносниками кисню.

Тонкі фізико-хімічні дослідження дозволили встановити, що в клітині нараховується понад 2,4 млн різноманітних білкових молекул 1850 видів.

Нуклеїнові кислоти представлено дезоксирибонуклеїновою (ДНК) та рибонуклеїновою (РНК) кислотами. Їх вміст коливається в межах 25-30 % сухої маси. У клітині є дві молекули ДНК та понад 250 тисяч молекул РНК. Останні можна поділити на три групи: рибосомальні РНК, транспортні РНК і матричні (інформаційні) РНК. Матрична РНК - форма, що утворюється в процесі біосинтезу білка. Вона забезпечує передачу генетичної інформації на білок, тобто елонгацію (подовження) поліпептидних ланцюгів. Рибосомальні РНК входять до складу великих і малих субодиниць рибосом. Вони відрізняються від РНК еукаріотів  за константою седиментації. Транспортні РНК  здатні звязуватись із амінокислотами, що накопичуються в цитоплазмі, й доставляти їх до рибосом, на яких відбувається процес біосинтезу.

Вуглеводи становлять 12-20 % сухого залишку. Їх представлено різноманітними цукрами, багатоатомними спиртами, оліго-та поліозидами, полісахаридами, іншими сполуками. Їх роль у забезпеченні життєдіяльності клітини важко переоцінити, так як  вони входять до складу будь-яких структур клітини. Прості цукри є субстратом, з яких синтезуються більш складні сполуки. Полісахариди різних бактерій відрізняються за своєю специфічністю. Вони зумовлюють антигенні властивості клітини, їх вірулентні (капсули пневмококів) властивості.

Відмінності у будові бактеріальних полісахаридів лягли в основу розробки методів хемотаксономії мікробів, їх ідентифікації. Особливості складу полісахаридів оболонки дозволяють одержувати вакцини, специфічні діагностичні сироватки.

У клітині міститься  в середньому до 10 % ліпідів. Однак в окремих груп мікроорганізмів (мікобактерії, рикетсії) ця частка збільшується до 40 %. У грамнегативних бактерій в звязку з особливостями будови клітинної стінки їх у 2-5 разів більше, ніж у грампозитивних.

В середньому в клітині є до 22 млн молекул  різноманітних ліпідів. Представлено їх, в основному, жирними насиченими й ненасиченими жирними кислотами, ефірами жирних кислот і гліцерину, восками, фосфоліпідами. Вони зумовлюють захисні властивості  клітини (кислотостійкість), її токсичні функції,  беруть участь у метаболізмі.

Важливою складовою частиною будь-якої мікробної клітини є мінеральні елементи. Вони входять до складу вітамінів, ферментів, білків і можуть  знаходитись у вільному стані в цитоплазмі. Без них не обходяться біохімічні реакції. Загальна їх кількість у мікробах може досягати 2-4 % сухого залишку. Зокрема, сірка і фосфор, їх похідні  за рахунок здатності утворювати макроергічні (багаті на енергію) звязки постачають клітину енергією. Калій і натрій необхідні для нормальної життєдіяльності бактерій, забезпечують функціонування натріє-калієвого насосу. Магній й кальцій  здатні активувати багато ферментів; залізо - невідємний складник цитохромів.

Клітинний метаболізм. Сукупність усіх біохімічних   перетворень у клітині називається метаболізмом. Він відбувається за двома основними напрямками. Перший забезпечує синтез складних клітинних сполук із більш простих. Тому він одержав назву біосинтез, конструктивний метаболізм або  анаболізм. Однак переважна  більшість реакцій синтезу й розпаду потребує енергетичного забезпечення. Тому енергетичний метаболізм або катаболізм представляє собою потік реакцій, які супроводжуються накопиченням електрохімічної енергії, що потім викорстовується клітиною.

Конструктивний та енергетичний метаболізм  - тісно повязаний між собою комплекс перетворень, часто їх шляхи співпадають, і одні й ті ж речовини використовуються для різних потреб. У цьому випадку такі субстрати називаються амфіболітами, а шляхи - амфіболічними.

Метаболічні цикли мікробів надзвичайно різноманітні. Вони здатні використовувати різні види енергії й численні вихідні субстрати для побудови  власних структур. Саме цим зумовлюється убіквітарність їх розповсюдження.

Конструктивний метаболіз прокаріотів. Для того, щоб клітина могла існувати, повинен відбуватись постійний обмін речовин з навколишнім середовищем. У клітину ззовні мусить надходити  пластичний матеріал, з якого вона  синтезує всі необхідні їй молекули.

У конструктивному метаболізмі провідна роль належить сполукам вуглецю, з якого побудовано всі живі організми. Залежно від того, який вуглець засвоюють бактерії, вони поділяються на дві групи: автотрофи і гетеротрофи.

Типи метаболізму бактерій

Тип живлення

Джерела енергії, H/e-, вуглецю

Приклади мікроорганізмів

 Фотолітотрофи -

автотрофи

Енергія світла

Неорганічні донори H/e- CO2 джерело вуглецю

Водорослі

сульфобактерії

ціанобактерії

Фотоорганотрофи – гетеротрофи

Енергія світла,

Органічні донори  H/e-

Органічні джерела вуглецю

Пурпурні і зелені бактерії

  Хемолітотрофи -

автотрофи

Хімічні джерела енергії (неорганічні)

Неорганічні донори H/e-

CO2 джерело вуглецю

Нітрифікуючі бактерії, залізобактерії

Хемоорганотрофи-

 гетеротрофи

Хімічні джерела енергії (органічні)

Органічні донори H/e-

Органічні джерела вуглецю

Найпростіші

Гриби

Більшість бактерій

 

Автотрофи (autos - сам, trophe - живлення) здатні синтезувати всі необхідні їм органічні сполуки з CO2 як єдиного джерела вуглецю.  Гетеротрофи (heteros -інший) - мікроорганізми, джерелом вуглецю для яких є органічні сполуки. Вони здатні  споживати  будь-які прості й складні вуглецеві сполуки - цукри, амінокислоти, багатоатомні спирти, парафіни та ін.

Ступінь вираження гетеротрофії у бактерій може бути найрізноманітніша.  Найвищу гетеротрофність мають прокаріотичні організми, які здатні жити тільки всередині  живих клітин (рикетсії, хламідії). Їх метаболічні шляхи повністю залежать від організму хазяїна. Такі мікрорганізми називають облігатними (суворими) паразитами.

Однак багато мікробів можна вирощувати на штучних живильних середовищах, до складу яких входять білки, пептиди, вітаміни, фрегменти нуклеїнових кислот. Такі форми бактерій, здатних рости поза клітинами людини або тварин при створенні необхідних умов, називають  факультативними паразитами.

Більшість бактерій, що населяють земну кулю (понад 99 %), належать до сапрофітів. Вони безпосередньо від живих організмів не залежать  і живляться за рахунок мертвих органічних залишків.

Мікроорганізмам необхідний азот для синтезу азотомістких сполук. Джерела його можуть бути різноманітними. Одні бактерії здатні засвоювати молекулярний азот повітря (бульбочкові мікроби), інші використовують різноманітні субстрати. Бактерії, як правило,  засвоюють азот у відновленій формі - це солі амонію, сечовини, органічні сполуки  (амінокислоти, пептиди). Однак окислені форми азотистих сполук (нітрати) також можуть бути засвоєні мікробами. У клітині вони  відновлюються до аміаку за допомогою ферментів нітратредуктази й нітритредуктази.

Дикі штами бактерій здатні синтезувати всі необхідні їм речовини з обмеженого числа органічних сполук, наприклад, глюкози та солей амонію. Вони називаються прототрофами. Окремі мікроорганізми  (варіанти прототрофів) втратили здатність до синтезу деяких необхідних їм ростових факторів, отже не можуть рости на мінімальних живильних середовищах. Їх називають ауксотрофними організмами.

Джерела енергії та донори електронів. Залежно  від джерела енергії, що засвоюють мікробні клітини, їх поділяють на фототрофи і хемотрофи.

Фототрофні бактерії здатні використовувати енергію сонячного світла. Їх інакше називають фотосинтезуючими бактеріями. Патогенних для людини серед них   немає.  Інші прокаріоти, які  одержують енергію за рахунок окисно-відновних реакцій в субстратах, називаються хемотрофами.

Для здійснення різноманітних реакцій клітині необхідні електрони. Речовини, які в процесах біохімічних перетворень віддають електрони, називаються донорами. Молекули, які одержують електрони, називаються акцепторами.

Мікроорганізми, для яких джерелом електронів є неорганічні сполуки типу Н2, Н2S, NH3+ , Fe +2 та інші, називаються літотрофами (litos - камінь). Інші бактерії, для яких донором електронів  виступають органічні речовини, називаються органотрофами.

Залежно від способу одержання енергії, донора електронів та джерела вуглецю для засвоєння можна виділити 8 основних типів прокаріотичних організмів: фотолітоавтотрофи й фотолітогетеротрофи, фотоорганоавтотрофи й фотоорганогетеротрофи, хемолітоавтотрофи й хемолітогетеротрофи, хемооргано-автотрофи й хемоорганогетеротрофи.

Мікроорганізми, які здатні викликати у людини захворювання, належать до хемоорганогетеротрофів.

Бактерії, яким притаманний один із спосібів живлення, позначають як облігатні,  а ті, які використовують два джерела енергії, - міксотрофи.

Для здійснення своїх метаболічних перетворень і забезпечення життєдіяльності клітина потребує інші неорганічні сполуки. Так, сірка входить до складу деяких амінокислот (метіонін, цистеїн), вітамінів та кофакторів (біотин, ліпоєва кислота, кофермент А), а без фосфору неможливо синтезувати нуклеїнові кислоти, він  необхідний компонент фосфоліпідів, коферментів.

Мікроорганізми  засвоюють сірку з природних джерел, де вона знаходиться у формі неорганічних солей (сульфатів, сульфідів) або елементарної сірки, а потреби у фосфорі задовільняються за рахунок  засвоєння неорганічних фосфатів.

Усі необхідні йони металів клітина одержує за рахунок неорганічних сполук. Деякі елементи (магній, кальцій, калій, залізо) потрібні в досить великих концентраціях. Потреби в інших (цинк, марганець, молібден, ванадій, кобальт) незначні. Проте їх роль у клітині надзвичайно різноманітна, так як вони входять до складу  основних клітинних метаболітів, виконуючи життєво важливі функції.

При культивуванні бактерій крім білків, жирів та вуглеводів, які надходять у клітину з навколишнього середовища, до середовищ додають речовини, які виконують функцію стимуляторів росту.  Вони включаються до складу клітинних метаболітів, каталізують біохімічні перетворення. Такими факторами є деякі вітаміни (біотин,  тіамін, пантотенова кислота, холін, ціанокобаламін, нікотинова та фолієва кислоти), пуринові та піримідинові основи, жирні кислоти, гемін, коензим ферменту дегідрогенази.

   Надходження речовин у клітину.

Незважаючи на досягнення мікробіологічної науки у вивченні процесів обміну в бактеріальній клітині остаточно інтимні механізми транспорту поживних речовин в клітину і виведення метаболітів назовні не зясовано. Встановлено, що мікробам притаманний  голофітний тип живлення, тобто вони здатні поглинати живильні речовини тільки в розчиненому вигляді . 

Однак деякі субстрати не розчиняються у воді (білки, полісахариди), або  утворюють колоїдні розчини, які не проникають у клітину. В такому випадку клітинні екзоферменти, які виділяються  в навколишнє середовище, викликають гідроліз цих субстанцій, розщеплюючи їх до більш простих і дрібних молекул і переводячи в розчинний стан.

Виділяють декілька механізмів проникнення  речовин. Пасивна дифузія функціонує тоді, коли створюється градієнт концентрації речовини всередині бактеріальної клітини та зовні. Вона відбувається пасивно, тому що не вимагає затрат енергії.

Полегшена дифузія здійснюється за рахунок особливих білків - пермеаз, які містяться в цитоплазматичній мембрані. Цей процес також не вимагає енергетичного забезпечення.

 

Описание: Полег_диф

 

Однак більшість поживних речовин,  метаболітів, іонів проникають у клітину за допомогою активного транспорту. Його також забезпечують білки-пермеази, але вони є  високоспецифічними й здатні переносити тільки певні субстрати. Цей процес відбувається за рахунок енергії, яку генерує  клітина, тому можливий перенос і проти градієнта концентрації речовини. Якщо цьому процесу передує певна хімічна модифікація  молекули, його називають транслокацією хімічних груп. Виділяють також механізм іонного транспорту, при якому відбувається перенос у клітину окремих неорганічних іонів.

Конструктивний метаболізм. Обмін білків у мікроорганізмів відбувається за двома основними напрямками: розщеплення поліпептидів до амінокислот і біосинтетичні процеси, повязані з конструюванням нових молекул.  Перший напрямок забезпечують ферменти екзопротеази, що виділяються в навколишнє середовище,  та ендопротеази, які нагромаджуються в клітині. Кінцеві продукти -амінокислоти, - що утворюються під час цього процесу, можуть зазнавати дезамінування та декарбоксилювання, перетворюючись на аміак, вуглекислий газ, оксикислоти.

Біосинтетичні процеси відбуваються за участю готових амінокислот, які трансамінуються або перамінуються. Деякі мікрорганізми здатні синтезувати амінокислоти з простих сполук азоту. Необхідно зазначити, що мікроорганізми, на відміну від клітин організму людини, здатні синтезувати незамінні амінокислоти - лізин, метіонін, триптофан.

Вуглеводний обмін забезпечуєтся або гідролітичним розщепленням молекул з утворенням глюкози й мальтози або фосфоролізом. І в одному, і в іншому випадках процеси не супроводжуються вивільненням енергії. Це відбувається при бродінні -  окисно-відновних реакціях анаеробного розщеплення органічних речовин, головним чином, вуглеводів. Метаболіти, які утворюються під час бродіння, використовуються для біосинтетичних процесів. Продуктами бродіння є різні органічні кислоти (молочна, масляна, оцтова, мурашина), спирти (етиловий, бутиловий, пропіловий), ацетон, диоксид вуглецю, водень. Залежно від того, який основний продукт накопичується в середовищі, розрізняють молочнокисле, маслянокисле, мурашинокисле, спиртове та інші види бродіння. При бродінні вивільняється  незначна частка енергії, яка накопичена в речовині. Як правило, на 1 молекулу субстрату утворюється 2 молекули аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ).

Синтез вуглеводів відбувається або з вуглекислого газу (автотрофи), або за рахунок  вуглецемістких органічних сполук.

Як було зазначено, ліпіди мікроорганізмів представлено насиченими та ненасиченими жирними кислотами, фосфоліпідами, стеринами, восками, каротиноїдами та іншими речовинами. Мікроорганізми здатні до синтезу вищих жирних кислот, який відбувається за участю особливих білків, що переносять ацильні фрагменти. Часто з цією метою клітини використовують метіонін. Синтезовані ліпіди включаються до складу фосфоліпідів. Розщеплення ліпідів відбувається за участю ліпаз та інших ліполітичних ферментів.

Ферменти мікроорганізмів. Усі біосинтетичні процеси  та інші метаболічні перетворення в клітині відбуваються  за участю особливих  високоактивних біологічних каталізаторів, які називаються ферментами.  Вони належать до 6 класів: гідролази (забезпечують реакції розщеплення за участю води), оксидоредуктази (каталізують різноманітні окисно-відновні реакції, беруть участь  у процесах дихання), ізомерази (здійснюють перенос фосфатних груп у молекулах, спонукаючи процеси ізомеризації), трансферази (переносять аміногрупи, аденілові групи з одних субстратів на інші), ліази (каталізують реакції відщеплення хімічних груп негідролітичним шляхом),  лігази (відповідають за синтез нових речовин, який відбувається за рахуноко енергії АТФ).

Здатність утворювати певні ферменти кодується клітинним геномом і є постійною ознакою бактерій. Так як бактеріальна клітина займає невеликий обєм, у ній переважають адаптивні ферменти над конститутивними. Перша група ферментів синтезується тільки за умов наявності субстрату для їх дії. Ферменти другої групи постійно присутні в бактерії  в певних концентраціях. Вони зумовлюють першочергові біосинтетичні потреби клітин.

Клітина виділяє  ферменти в навколишнє середовище (екзоферменти). Там вони здійснюють   контактне позаклітинне  перетравлювання речовин або пошкоджують тканини організму господаря. Ендоферменти  локалізуються на цитоплазматичній мембрані, в периплазматичному просторі.

Класифікація ферментів бактерій

 

ГІДРОЛАЗИ                                       АДАПТИВНІ

 ОКСИДОРЕДУКТАЗИ                 КОНСТИТУТИВНІ

 ІЗОМЕРАЗИ

 ТРАНСФЕРАЗИ

 ЛІАЗИ

 ЛІГАЗИ

 

                                    ЕНДОФЕРМЕНТИ

                                    ЕКЗОФЕРМЕНТИ

 

 

Роль ферментативної діяльності мікроорганізмів важко переоцінити. Вони мають загальнобіологічне значення. Відома участь бактерій  у кругообізі речовин у природі, формуванні родовищ корисних копалин (нафта, вугілля, поклади сірки). Мікроорганізми - прекрасні санітари довкілля. Вони здатні біодеградувати практично будь-які речовини, що забруднюють навколишнє середовище.

Людина поставила мікробні ферменти собі на службу. Їх широко використовують у різних галузях хімічної, харчової, фармацевтичної, парфумерної  промисловостей, сільському господарстві, медицині.

Протеазами видаляють волосяний покрив зі шкір тварин, знімають желатиновий шар з кіноплівки. Ферменти, що забезпечують бродіння,  використовуються для одержання бутанолу, ацетону, необхідних для проведення хроматографічних досліджень, етилового спирту, масляної кислоти. Кисломолочні продукти - кефір, йогурт, кисляк, кумис - також продукти діяльності бактерій бродіння.

Мікроорганізми використовуються у виноробстві, виробництві пива, при виготовленні вершкового масла,  силосуванні кормів, квашенні овочів. Із дріжджів одержують білково-кормові добавки для вигодовування худоби. Як живильне середовище використовують парафіни - відходи нафти.

За допомогою мікроорганізмів та їх ферментних систем в медичній промисловості одержують  гормони гідрокортизон, преднізолон, різноманітні алкалоїди. Пропіонібактерії, актиноміцети синтезують вітаміни (В12­). Зі стрептококів одержано фібринолізин, стрептодорназу і стрептокіназу, які руйнують тромби в кровоносних судинах.

Оскільки здатність утворювати ферменти певної специфічності притаманна всім мікроорганізмам, це широко використовується в лабораторній практиці для ідентифікації бактерій. Її проводять за комплексом цукролітичних, протеолітичних, пептолітичних, ліполітичних та інших ферментів.

Енергетичний метаболізм прокаріотів.  За своїм обємом реакції, що забезпечують клітину внутрішньою енергією, значно  перевищують  біосинтетичні процеси.

Мікроорганізми можуть використовувати не всі форми енергії, що існують у природі. Вони здатні користуватись тільки енергією сонячного світла (фотосинтезуючі бактерії) та хімічною (хемотрофні мікроби). Недоступні для них ядерна, механічна та теплова енергії.

Явище  нагромадження  енергії розглядається як перенос іонів водню шляхом окремого транспорту протонів та електронів: протони при цьому виділяються в навколишнє середовище, а електрони передаються на відповідні молекули- акцептори.

Протягом своєї еволюції бактерії виробили три способи одержання енергії: бродіння, дихання і фотосинтез.

При бродінні в анаеробних умовах у певних окислювально-відновних реакціях утворюються нестабільні молекули, фосфатна група яких  містить багато вільної енергії. Вона переноситься на молекулу аденозиндифосфорної кислоти (АДФ), яка перетворюється в  АТФ. Реакції, в яких енергія запасається на АТФ, одержали назву субстратного фосфорилювання. Відновлювач, який при цьому утворюється, (НАД·Н2, відновлений  фередоксин), переносить  електрони на ендогенний акцептор (піруват, ацетальдегід) або звільняється у вигляді водню.

Окислення  відбувається внаслідок переносу електронів через спеціальний електроннотранспортний ланцюг, локалізований на мембрані. Він складається  з набору переносників і в більшості випадків спричиняє відновлення молекулярного кисню до Н2О.

Основою фотосинтетичних процесів у представників мікробного світу є поглинання сонячної енергії різними пігментами: флавопротеїнами, хінонами, цитохромами і білками, що містять негемове залізо. Вони й забезпечують перенос електронів і, відповідно, вивільнення енергії.

Енергія, яку генерує клітина, запасається у формі електрохімічного трансмембранного градієнта іонів водню - Dmн+  або в молекулах АТФ.

Прокаріоти містять декілька сполук із високоенергетичними фосфатними звязками - ацилфосфати, фосфоенолпіруват, аденозинфосфосульфат, а також сполуки з тіоефірним звязком - ацилтіоефіри. У цих речовинах одна з груп має великий енергетичний потенціал. Перенос її веде до розриву звязку, зєднуючого з молекулою, отже, до різкого зменшення вільної енергії, накопиченої в клітині. Приєднання такої групи до молекули акцептора підвищує рівень його вільної енергії, переводячи молекулу в активовану форму, що здатна брати участь у біосинтетичних реакціях.

Найголовніше місце в переносі хімічної енергії належить системі АТФ. Вона утворюється при субстратному та мембранозалежному фосфорилюванні. При цьому від субстрату відщеплюється фосфатна група і переноситься на молекулу АДФ. Вона містить два макроергічних звязки, які при гідролізі звільняють  31,8 кДж/моль енергії. Молекули АТФ вважають енергетичною валютою клітини, а малі розміри дозволяють їм легко дифундувати в ті ділянки кілтини, де необхідна енергія. Підраховано, що для подвоєння клітинної маси молекула АТФ повинна біля 10000 разів брати участь у процесах гідролізу й синтезу.

На прикладі  E. coli визначено, скільки необхідно енергії,  щоб синтезувався 1 г клітинної речовини. Це потребує 37 ммоль АТФ, із них 20 ммоль використовується на синтез білка, 7 ммоль - на синтез ДНК і РНК, 2 ммоль - для полімеризації цукрів. Решта іде на підтримання життєдіяльності  - осмос, рух клітини тощо.

Іншою універсальною клітинною енергією є енергія трансмембранного потенціалу Dmн+. Це здійснюється за допомогою спеціальної «петлі», локалізованої в цитоплазматичній мембрані. Переносники хінони забезпечують рух двох атомів водню від внутрішньої сторони ЦПМ назовні. Потім цитохроми повертають в клітину два електрони, а протони  вивільняються в зовнішнє середовище.

При такому переносі  назовні клітини накопичуються іони водню, середовище підкислюється, а в цитоплазмі їх число зменшується, і вона набуває більш лужного характеру. Виникає орієнтований поперек ЦПМ градієнт іонів водню. Оскільки Н+ - хімічні частинки з позитивним зарядом, то їх накопичення з обох сторін ЦПМ викликає створення  не тільки концентраційного градієнта часток, але й орієнтованого поперек мембрани електричного поля. Напруга потенціалу Dmн+  досягає 200-250 мВ.

Енергія трансмембранного потенціалу може розряджатись за участю локалізованого в мембрані протонного АТФ-синтетазного комплексу. Це створює можливість з АДФ та неорганічного фосфату без будь-яких проміжних сполук утворити молекули АТФ. Однак процес може проходити і в протилежному напрямку. Тоді при гідролізі АТФ зростає  енергія Dmн+ на ЦПМ.

Таким чином, дані реакції є природними механізмами, які зєднують процеси окислення з фосфорилюванням. Енергія, яка накопичується на мембрані, та енергія АТФ забезпечують різні потреби клітини. Перша поглинається ДНК при генетичній трансформації, зумовлює рух бактерій за допомогою джгутиків, забезпечує активний перенос речовин та іонів через мембрану, а енергія АТФ  - синтетичні процеси в клітині.

Але ні енергія Dmн+, ні АТФ не можуть нагромаджуватись і зберігатись в клітині достатньо довгий строк, адже тривалість життя молекули АТФ всього 1/3 с. Для консервування енергії прокаріоти створили механізм синтезу високополімерних молекул, полісахаридів, ліпідів або поліпептидів. Ці речовини упаковуються в спеціальні гранули, вкриваються оболонкою і зберігаються в неактивному стані.

 

РІСТ І РОЗМНОЖЕННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Будь-яка жива істота здатна до росту та розмноження. Під ростом розуміють координоване відтворення бактеріальних структур і відповідно збільшення маси мікробної клітини. Розмноження - це здатність мікробів до самовідтворення, при цьому збільшується кількість особин у популяції на одиницю обєму середовища

Розмноження бактерій - складний процес, повязаний із синхронною взаємодією багатьох їх структур. Починається воно з відтворення генетичного матеріалу - ДНК, яка локалізована в нуклеоїді. Спочатку відбувається реплікація (подвоєння) генетичного матеріалу напівконсервативним шляхом. Розпочинається вона з реплікативної точки на ДНК, розташованої  в місці зєднання мезосоми з цитоплазматичною мембраною. Нуклеїнова кислота деспіралізується, й нитки ДНК розходяться. Кожна з них є матрицею, на якій  за принципом комплементарності  синтезуються їх копії,  які згодом обєднуються у двониткову ДНК. Синтез дочірніх ниток ДНК відбувається ступенево, невеликими фрагментами по 1-2 тис. нуклеотидів, які пізніше зшиваються ферментом лігазою. Залежно від умов, реплікація може тривати 20-40 хвилин.

Паралельно з реплікацією починається утворення поперечної перегородки за рахунок цитоплазматичної мембрани. Потім вона оточується пептидогліканом. Під час реплікації та утворення перегородки клітина росте, синтезуються біополімери, з яких складатимуться цитоплазматична мембрана, рибосоми, цитоплазма.

Клітини відділяються одна від іншої, а в грамнегативних  мікробів  синтезується додатково зовнішня мембрана. Якщо клітини зберігають звязки, утворюються ланцюги з кокоподібних чи паличкоподібних форм.

Поділ клітин може відбуватись за трьома типами. Випереджаючий - такий тип, при якому утворюються багатоклітинні палички і коки. При синхронному реплікація нуклеоїду супроводжується поділом клітини, й утворюються одноклітинні організми. Третій тип - із випереджаючим поділом нуклеоїду, при якому  утворюються багатонуклеоїдні форми бактерій.

Як правило, бактерії розмножуються простим поділом, що відбувається в різних площинах. Це спричиняє, наприклад,  утворення   різних морфологічних типів кокоподібних мікроорганізмів - диплококів,  стафілококів, тетеракоків, сарцин. Актиноміцети можуть розмножуватись шляхом фрагментації ниткоподібних клітин, брунькуванням. Можливо утворення клітин, подібних до спор, конідій.

Облігатні внутрішньоклітинні паразити - хламідії - розмножуються, проходячи ряд стадій: елементарні тільця, ініціальні тільця, проміжні тільця. Саме останні є тим джерелом, з якого формується  нове покоління  елементарних тілець. Тривалість циклу складає 40-48 годин.

Мікоплазми також можуть утворювати особливі елементарні тіла, що здатні до розмноження фрагментацією або брунькуванням. Однак вони можуть розмножуватись  і простим бінарним поділом.

Швидкість розмноження бактерій залежить від багатьох факторів: віку культури, складу живильного середовища, його рН, окисно-відновного потенціалу, температури, аерації тощо.

Бактерії розмножуються у геометричній прогресії. Якщо вважати, що за оптимальних умов бактерія подвоюється кожні 30 хвилин, то за годину їх буде 4, через дві години - 16, через 4 - 256, через 15 - мільйони. Через 35 год їх обєм становитиме  до 1000 м3, а маса - понад 400 т.

При внесенні у живильне середовище бактерії розмножуються за певними закономірностями. Вони ростуть і розмножуються, досягаючи певного максимуму до того часу, поки не будуть вичерпані запаси живильних речовин. Якщо не видаляти кінцеві продукти обміну і не додавати необхідні речовини, то можна одержати періодичну культуру (популяція в обмеженому просторі). Мікроорганізми в такій культурі ведуть себе як багатоклітинні системи з генетично обмеженим ростом.

Крива, яка описує залежність логарифму числа живих клітин від  часу культивування, називається кривою росту.

Описание: Curve2

 

 

Розрізняють чотири основні фази росту періодичної культури: початкову (або лаг-) фазу, експоненціальну (або логарифмічну) фазу, стаціонарну та фазу відмирання.

Початкова або лаг-фаза охоплює проміжок між інокуляцією бактерій і досягненням найвищої швидкості їх поділу. В цей період відбувається адаптація бактерій до умов існування. В клітині у 8-12 разів зростає кількість РНК, збільшується концентрація ферментів. Тривалість фази 1-2 год.

Експоненціальна (логарифмічна)  фаза характеризується постійною максимальною швидкістю поділу клітин і зростанням їх кількості у геометричній прогресії.  Вона залежить від віку мікробів і складу середовища. Так, ентеробактерії діляться кожні 15-30 хв, стрептококи - 30 хв, а грунтові нітробактерії й збудники туберкульозу - 5-18 год. Час,  протягом якого відбувається поділ мікроба, називається часом генерації. Тривалість фази - 5-8 год.

Стаціонарна фаза наступає тоді, коли число клітин перестає збільшуватись. Настає рівновага між кількістю живих мікробів і тих, що відмирають. Цьому сприяє висока щільність популяції, дефіцит живильних речовин у середовищі, низький парціальний  тиск кисню, накопичення токсичних продуктів обміну. Однак кількість біомаси в цей період  сягає найвищого рівня, тому концентрацію клітин позначають як максимальну (М-) концентрацію, а величину біомаси - терміном вихід або урожай. Ця ознака є  специфічною й характерною  для кожного  виду бактерій. Триває фаза 6-7 год.

Фаза відмирання (до 10 год) супроводжується різким зменшенням  числа живих клітин. Цьому сприяють значний дефіцит поживних речовин у середовищі, нагромадження кислот, автоліз під впливом  власних ферментів.

 

 

Поділ мікроорганізмів за температурним оптимумом

Мікроорганізми

Т е м п е р а т у р н и й

оптимум

максимум

мінімум

Термофіли

50-60 °С

75 °С

45 °С

Мезофіли

30-37 °С

43-45 °С

15-20 °С

Психрофіли

10-15 °С

25-30 °С

0-5 °С

 

Отже, у періодичній культурі умови культивування весь час змінюються: густина мікробів  зростає, а запаси живильних речовин зменшуються. Однак у багатьох випадках необхідно підтримувати клітини у фазі експоненціальнго росту та М-концентрації, тому що саме в цей період вони найбільш фізіологічно і функціонально активні: синтезують багато білка, продукують велику кількість різноманітних ферментів, токсинів, антибіотиків, інших біологічно активних речовин. Це досягається постійним видаленням популяцій бактерій, що ростуть, оновленням  живильного середовища, додатковою аерацією (для аеробних бактерій). Саме за такими принципами працюють хемостати і турбідостати - прилади, які дозволяють проводити безперервне культивування у промислових і лабораторних умовах.

 Ріст мікробів на твердих живильних середовищах відбувається за аналогічними закономірностями, однак щільність клітин значно вища.

 

Поділ бактерій за типом дихання

n  Облігатні аероби (збудники туберкульозу, чуми, холери)

n  Облігатні анаероби (збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії)

n  Факультативні анаероби (стафілококи, ешеріхії, сальмонели, шигели та інші)

n  Мікроаерофіли (молочнокислі, азотфіксуючі бактерії)

n  Капнеїчні (збудник бруцельозу бичачого типу)

 

Дихання бактерій. Це один із шляхів біологічного окислення, який відбувається з утворенням молекул АТФ, тобто супроводжується нагромадженням енергії. Під час цього процесу одні речовини (органічні  та неорганічні сполуки) служать донорами електронів і при цьому окислюються, акцепторами електронів виступають неорганічні сполуки, вони відновлюються. В одних мікроорганізмів кінцевим акцептором електронів виступає кисень, у інших  - неорганічні сульфати, нітрати, карбонати.

Л. Пастером було вперше помічено, що деякі мікроби одержують енергію без участі  кисню. У 1863 р. він запропонував терміни «аероб» та «анаероб».

Сьогодні, залежно від умов одержання енергії (способу дихання), прокаріоти поділяються на ряд груп.  Облігатні  аероби - мікроорганізми, для оптимальнгоо росту яких необхідно 21 % кисню. До них належать збудники туберкульозу, чуми, холерний вібріон. На поверхні рідких живильних середовищ вони ростуть, як правило, у вигляді плівки.

 

Описание: Описание: phys35

 

 Облігатні анаероби - бактерії, які ростуть при відсутності вільного молекулярного кисню за рахунок процесів бродіння. Вони одержують кисень з органічних сполук у процесі їх метаболізму. Деякі з них не виносять навіть незначної кількості вільного кисню. Такими бактеріями є  збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії та ін. Окремі клостридії можуть бути аеротолерантними. Для культивування їх використовують спеціальні живильні середовища й апарати (анаеростати), в яких створюються анаеробні умови за рахунок поглинання кисню або заміни його індиферентиними газами (азотом, воднем).  Факультативні анаероби (факультативні аероби) пристосувались, залежно від умов середовища (наявності або відсутності кисню), переключати свої метаболічні процеси з використанням молекулярного кисню на бродіння та навпаки. Групу факультативних анаеробів формують численні представники родини  кишкових бактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафілококи та деякі інші бактерії. Мікроаерофіли - особлива група мікробів, для яких концентрація кисню при культивуванні може бути зменшена до 2 %. Вищі його концентрації здатні затримувати ріст. Ця група представлена молочнокислими, азотфіксуючими бактеріями. Капнеїчними називають такі мікроорганізми, які потребують, крім кисню, ще й до 10 % вуглекислого газу. Типовими представниками є  збудники бруцельозу бичачого типу.

В облігатних аеробів кисень використовується як кінцевий акцептор електронів у реакціях, що каталізуються цитохромоксидазами та оксигеназами. В клітинах факультативних анаеробів  також є  цитохромоксидази, проте в облігатних анаеробів ферментів, які каталізують взаємодію з молекулярним киснем, немає.

 

Описание: Описание: phys33

Система Газ-пак для створення анаеробних умов

 

Детальне вивчення механізмів дихання у бактерій довело, що першими мікроорганізмами на земній кулі були анаероби, так як до виникнення фотосинтезуючих еукаріотів вміст кисню в атмосфері був незначним порівняно із сьогоденням. За розрахунками, щоб  відбулось переключення механізму бродіння на аеробне дихання,  достатньо було 0,2 %  кисню в атмосфері (на сьогодні його концентрація становить 21 %). У свою чергу зростання вмісту кисню призвело до зміни характеру атмосфери із відновлювальної  на окисну за рахунок відповідних реакцій. В умовах безкисневої атмосфери існував дефіцит акцепторів електронів, а з появою кисню ця проблема була розвязана.

 

Стерилізація – повне знищення вегетативних і спорових форм усіх мікроорганізмів на певних предметах, матеріалах, живильних середовищах.

Види стерилізації:

     Прожарювання в полум’ї пальника

     кип’ятіння

     Текучою парою

     Парою під тиском в автоклаві

     Сухим жаром

     Пастеризація

     Тиндалізація

     Хімічна

     Холодна (механічна)

 

СТЕРИЛІЗАЦІЯ МЕХАНІЧНИМ СПОСОБОМ

Описание: Water

 

Тиндалізація – стерилізація на водяній бані, при температурі 58-60°С протягом години 5-6 днів підряд.

Пастеризація – одноразове прогрівання матеріалу до температури нижче 100 °С, при якій знищуються, в першу чергу вегетативні форми мікроорганізмів.

Дезинфекція – сукупність фізичних, імічних і механічних способів знищення вегетативних і спорових форм патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів.

Види дезинфекції:

     Профілактична

     В епідемічному вогнищі

     Хімічна (хлоровмісні препарати, альдегіди, спирти і т.д.)

     Фізична (спалювання, дія жару, тиску, використання ультразвуку)

Антисептика – комплекс лікувально-профілактичних заходів, спрямованих на знищення або пригнічення росту мікробів у рані, на поверхні шкіри чи слизових оболонок.

Асептика – система профілактичних заходів, спрямованих проти проникнення мікробів у рану, тканини, органи хворого.

 

 

Основні методи стерилізації

Головний напрям у боротьбі з інфекційними хворобами – профілактичний. У зв’язку з цим у діяльності лікувальних закладів велике значення має попередження попадання збудників захворювань в організм людини або інші об’єкти. Це проводиться добре розробленими й апробованими методами мікробної деконтамінації. Основні з них – стерилізація, дезінфекція, антисептика та асептика.

Описание: Описание: Описание: Описание: Scheme_1

 

Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний, вільний від бактерій) – повне знищення вегетативних і спорових форм усіх мікроорганізмів на предметах, матеріалах, у живильних середовищах.

У медичній практиці стерилізують інструменти, перев’язочний і шовний матеріал, операційну білизну, лікарські препарати. У мікробіологічних лабораторіях – живильні середовища, пробірки, піпетки, колби, чашки Петрі тощо. Тому перед стерилізацією необхідно вміти підготувати інструменти, посуд, пробірки, піпетки, перев’язочний матеріал та інше.

Інструменти обробляють у такій послідовності. Спочатку їх прополіскують у проточній воді, потім замочують у миючому розчині 15 хв, миють у тому ж розчині 0,5-1 хв, прополіскують проточною і дистильованою водою, висушують у сухожаровій шафі при 80-85 °С до повного зникнення вологи.

Пробірки, флакони, колби закривають ватними пробками. Пробірки загортають у папір по 25-30 штук, а чашки Петрі – по 4-5 штук або вміщують у стерилізаційні коробки (бікси). Пастерівські й градуйовані піпетки з широкого кінця затикають ватою, обгортають папером або вміщують у картонні чи металеві пенали по 10-15 штук. Живильні середовища в колбах, флаконах, пробірках також закривають пробками.

У лабораторній практиці використовують такі види стерилізації: а) високою температурою; б) механічна (холодна); в) хімічними речовинами і газами.

Існує багато способів стерилізації з допомогою високої температури. Ефективність такої стерилізації при нагріванні характеризується показником D – ­часом, який необхідний при даній температурі, щоб отримати десятикратне зменшення популяції бактерій (на 90 %). Його величина вимірюється, як правило, у ­хвилинах.

Прожарювання в полум’ї пальника – швидкий й абсолютно надійний спосіб. Ним стерилізують бактерійні петлі, пінцети, предметні й покривні скельця.

Кип’ятіння протягом 40 хв у спеціальних стерилізаторах використовують для обробки хірургічних інструментів, шприців, голок, гумових трубок. Для підвищення температури кипіння й усунення жорсткості води додають 1 % бікарбонату натрію. Цей метод не забезпечує повної стерилізації, оскільки спори деяких видів бацил і клостридій витримують кип’ятіння протягом декількох годин.

Описание: Описание: Описание: Описание: R_01_shafa

Сухожарова шафа

 

Стерилізацію сухим жаром у сухожаровій шафі проводять при 160 °С протягом 120-150 хв, або при 180 °С – 45-60 хв після досягнення заданої температури (рис. 15). Стерилізують переважно скляний посуд. Перевага цього методу над іншими полягає в тому, що не пошкоджується скло, не відбувається корозії металевих інструментів. Його можна використати для стерилізації термостійких порошків та інших речовин. Одним з недоліків даного методу є достатньо тривалий строк стерилізації. Крім того, при високих температурах може відбутися обвуглювання і загоряння ватних пробок, паперу, в який загорнутий посуд.

 

 

Описание: IMG_0043

 

 

 

Стерилізація парою під тиском – найнадій­ніший метод повного знищення бактерій та їх спор. Він досягається дією пари, температура якої під тиском вища, ніж при кип’ятінні. Таку стерилізацію проводять в автоклаві. Стерилізація парою під тиском більш ефективна, ніж дія сухого жару.

Існують різноманітні електричні автоклави, які відрізняються між собою за розмірами, формою, розташуванням (вертикальні та горизонтальні), вони можуть бути з ручним керуванням, напівавтоматичні й автоматичні.

Описание: IMG_0042

 

 

 

         Конструктивно всі типи автоклавів представляють собою двостінний міцний металевий котел циліндричної форми з кришкою, яка герметично закривається, що дозволяє витримати високий тиск (рис. 16). Внутрішня частина автоклаву є стерилі­заційною камерою (1), в яку вміщують матеріал, що стерилізується. Вона має спеці­альний кран для виходу повітря (2) і манометр (3) із запобіжним клапаном (4). Манометр визначає робочий тиск пари в камері, а запобіжний клапан сприяє виходу надлишку пари з метою запобігання розриву автоклава. Дистильовану воду в водопарову камеру заливають через спеціальну лійку (6), стежачи за її рівнем у спеці­альній водомірній трубці (7). Пара із водопарової камери поступає в стерилізаційну камеру через спеціальні отвори в її верхній частині. Сучасні автоклави мають манометри і автоматичні регулятори включення і відключення струму, тримаючи ­заданий тиск, а отже й задану температуру всередині автоклава. Робота з ним вимагає суворого дотримання правил безпеки, які викладені в інструкції до кожного автоклава.

Основні правила роботи з автоклавом

1. Перед початком роботи слід ретельно оглянути автоклав, його контрольно-вимірювальну апаратуру, перевірити пружність резинової прокладки, кріплення кришки стерилізаційної камери.

2. Через спеціальну лійку до рівня відмітки на водомірній трубці в автоклав заливають дистильовану воду і закривають кран.

3. Необхідний матеріал вміщують у стерилізаційну камеру і закривають герметично кришкою автоклава. Бажано стежити, щоб предмети не розташовувались в автоклаві дуже тісно, оскільки між ним повинна проходити пара. В іншому випадку вони можуть залишитись нестерильними через відсутність нагріву до необхідної температури.

4. Відкривають кран, який з’єднує стерилізаційну камеру з оточуючим середовищем, і включають електричний нагрів.

5. Після того, як почався процес утворення пари, необхідно видалити повітря із стерилізаційної камери. Для цього пару і конденсат відводять у спеціальну посудину з водою або в каналізацію. Чисту пару, яка виходить з автоклава з рівномірним шиплячим звуком, протягом 10 хв пропускають через камеру, а потім закривають паровідвідний кран.

6. Доводять тиск пари до рівня, якого вимагає режим стерилізації. Для цього враховують співвідношення показників тиску манометра і температури кипіння води (табл. 1).

7. По завершенні циклу стерилізації автоклав відключають. Тиск в автоклаві поступово падає і зрівнюється з атмосферним. Тоді відкривають випускний кран і поступово випускають надлишок пари у посудину з водою. Недотримання цих правил може призвести до різкого зниження тиску, внаслідок чого рідина в пробірках, колбах, які стерилізувались, бурхливо закипає, змочуючи ватно-марлеві пробки і навіть виштовхуючи їх. Така ситуація порушує стерильність матеріалу.

В автоклаві при 120 °С протягом 20 хв стерилізують прості живильні середовища (МПБ, МПА), ізотонічні розчини, білизну, перев’язочний матеріал, а при 134 °С – знешкоджують заразні матеріали, відпрацьовані культури бактерій протягом 40 хв. Середовища з вуглеводами не витримують такої обробки, оскільки вони карамелізуються, у зв’язку з чим їх стерилізують текучою парою.

Стерилізація текучою парою (100 °С) проводиться в автоклаві з незагвинченою кришкою. При нагріванні пара проникає між вкладеними об’єктами й стерилізує їх. Таким способом обробляють середовища з вуглеводами. Оскільки одноразова дія пари не вбиває спори, застосовують дробну стерилізацію – 3 дні підряд по 30 хв. Ті спори, які не загинули при першому нагріванні, проростають до наступного дня у вегетативні клітини й гинуть при другій і третій обробці.

Для тих речовин, які не витримують 100 °С (білкові рідини, вітаміни, деякі ліки), застосовують тиндалізацію – стерилізацію на водяній бані при температурі 58-60 °С протягом години 5-6 днів підряд. Однак цей метод зараз широко не застосовується, оскільки вимагає значних затрат часу на його проведення.

Пастеризацією вважають одноразове прогрівання матеріалу до температури нижче 100 °С, при якій знищуються, в першу чергу, вегетативні форми мікроорганізмів. Цей спосіб вперше запропонував Л. Пастер для знищення безспорових форм мікробів, переважно патогенних і умовно-патогенних видів. Спори при цьому залишаються живими, а мікроорганізми, що залишились, стають помітно ослабленими. Метод широко використовують у харчовій промисловості, коли при кип’ятінні можуть втратитись органолептичні властивості продуктів. Так проводять термічну обробку молока, пива, вина, різних соків при 70 °С протягом 30 хв або при 80 °С – 5-10 хв. Пастеризовані продукти зберігаються на холоді.

Згортання (ущільнення) сироватки і яєчних середовищ з одночасною їх стерилізацією проводять у спеціальних згортувачах Коха з електричним піді­грівом (рис. 17). Асептично приготовлені сироватки та яєчні середовища у нахиленому положенні прогрівають однократно при 80-90 °С одну годину. При підозрі на мікробну контамінацію їх прогрівають при тій же температурі три дні підряд.

Механічні методи стерилізації широко використовуються в мікробіологічних лабораторіях. Особливо за тих умов, коли підвищена температура може зруйнувати субстрати. Це стосується рідких середовищ і рідин, які містять білки, вітаміни, антибіотики, вуглеводи, леткі речовини тощо. Метод можна застосувати для очищення бактеріальних токсинів, бактеріофагів від мікроорганізмів. Однак цей метод вважається менш надійним порівняно із класичною стерилізацією.

 

Описание: Описание: Описание: Описание: R_07_MEMBRANEN_FILTER

Фільтр

 

 

Залежність між надлишковим тиском пари, температурою кипіння води  і тривалістю стерилізації

 

Механічна (холодна) стерилізація проводиться за допомогою фільтрування через дрібнопористі антибактеріальні чи антивірусні фільтри. Їх створюють із спеціальних матеріалів, пронизаних порами, які мають різну форму та йдуть через фільтр звивисто. Фільтри можна виготовляти із позитивно зарядженого матеріалу, тоді бактерії, що несуть на поверхні негативний заряд ще й взаємодіють з ним електростатично, а не тільки механічно внаслідок різного діаметру бактерій і пор. Щоб попередньо перевірити якість фільтрів, використовують дрібні тест-мікроорганізми (Serratia marcescens або Pseudomоnas aeruginosa). Фільтрат висівають на живильне середовище і витримують при оптимальній температурі протягом 5 днів. При відсутності росту тест-бактерій можна застосовувати фільтр для стерилізації.

Промисловість різних країн випускає найрізноманітніші фільтри, які різняться за матеріалом виготовлення й діаметром пор. Мембранні або колоїдні фільтри, які виготовляють із нітроцелюлози, представляють собою диски діаметром до 35 мм. Нижче наведено характеристики різних фільтрів.

 

Типи фільтрів

 

Інший тип фільтрів, які виготовляють з інфузорної землі (діатоміту або кізельгуру), одержав назву свічок Беркефельда. За своїм зовнішнім виглядом вони подібні до циліндрів, замкнутих з одного з кінців. Свічки маркують літерами V, N i W, що відповідає діаметру пор в межах відповідно 8-12, 5-7 і 3-4 мкм.

Випускаються ще й стерилізуючі фільтри із скла „Пірекс” у вигляді двошарових дисків. Поділяють фільтри за розміром пор на три основних типи: С, М і Р. Розмір пор у них відповідно становить понад 1,7, від 1 до 1,7 і менше 1 мкм.

Перед роботою фільтр закріпляють у спеціальному тримачі. Зокрема, азбестові пластинки вміщують між циліндричною й опорною частиною металевого корпусу апарата Зейтца. Обидві частини з’єднують гвинтами. Зібраний фільтр вставляють у гумовий корок колби Бунзена з боковим відростком. Повністю вмонтований фільтр загортають у папір і стерилізують в автоклаві. Рідину для фільтрування наливають у металевий циліндр, з’єднують боковий відросток колби з вакуумним насосом, щоб створити вакуум у колбі й прискорити фільтрування. Фільтрат у колбі буде стерильним.

Хімічним способом стерилізують вироби з гумових і полімерних матеріалів. Для цього використовують 6 % розчин перекису водню, в який занурюють вироби на 6 год при 18 °С і на 3 год при 50 °С. Можна застосувати розчин дексона з експозицією 45 хв при 18 °С. Після закінчення стерилізації вироби двічі прополіскують у стерильній дистильованій воді, кожного разу змінюючи її, та переносять корнцангом у стерильний бікс.

Інструменти для ендоскопії й автоматичні піпетки можна також стерилізувати спиртом.

Газовий метод стерилізації парами формальдегіду, хлороформу, b-пропіолактону, окисом етилену, окисом пропілену, метилброміду, озоном використовують для знезараження ендоскопічних інструментів, апаратів для штучного кровообігу, радіоелектронного обладнання, пластмасових виробів, кетгуту тощо. Ефективною зарекомендувала себе суміш окису етилену і бромистого метилу в спів­відношенні 1:1,44. Для проведення стерилізації газом використовують спеці­альні щільні камери, які герметично закриваються. Для кожного діючого фактора розроблено свої режими стерилізації. Після завершення процедури газова суміш викачується з камери і замінюється стерильним повітрям. Предметами, які було простерилізовано вказаним способом, рекомендується користуватись не раніше, ніж через 24 год, для того, щоб видалився весь газ.

Одним із методів стерилізації є застосування різних типів опромінення. У практиці використовуються для цього електрони, гамма-промені, ультрафіолетові промені, радіочастотне опромінення.

Електронні прискорювачі дозволяють фокусувати електрони у вузький спря­мо­ваний пучок високої потужності. Цей метод використовують для стерилізації в промис­лових масштабах хірургічного перев’язочного і шовного матеріалів ще на етапі їх виробництва. Недоліком даного методу стерилізації є низька проникність променів.

До гамма-опромінення чутливі вегетативні та спорові форми різноманітних бактерій, грибів, дріжджів, віруси. Опромінення потужністю 2,5 Мрад використовується для знезараження антибіотиків, вітамінів, стероїдних та інших гормонів, пластмасового одноразового устаткування (чашок Петрі, шприців), хірургічного перев’язочного та шовного матеріалів тощо.

Стерилізацію за допомогою ультрафіолетового опромінення проводять для знешкодження бактерій в повітрі операційних, палат, боксів, мікробіологічних лабораторій тощо. Для цього використовують спеціальні бактерицидні лампи різної потужності – БУВ-15, БУВ-30 та ін. Однак слід пам’ятати, що мікроби можуть бути захищені від дії ультрафіолетового опромінення численними органічними речовинами, пилом та іншими факторами. Вегетативні форми бактерій у 3-10 разів більш чутливі до УФО, ніж спори.

Методи радіочастотного опромінення на сьогодні починають інтенсивно розроблятись, особливо у харчовій промисловості. Складність їх полягає в небезпеці для обслуговуючого персоналу (наприклад, перешкоди систем зв’язку, різна частота опромінення, яка застосовується для знешкодження мікроорганізмів).

Для перевірки ефективності стерилізації, надійності роботи автоклавів застосовують хімічний та біологічний контроль. Відомі хімічні речовини з певною температурою плавлення: бензонафтол – 110 °С, антипірин – 115 °С, сірка – 119 °С, бензойна кислота – 120-122 °С, манноза і сечовина – 132-133 °С. Саме при таких температурах найчастіше здійснюють стерилізацію. Хімічні речовини вміщують у скляні трубки, додають невелику кількість анілінового барвника (сафранін, фуксин або метиленовий синій), запаюють і кладуть між об’єктами, що стерилізуються. Рівномірне забарвлення препарату в колір барвника в трубці свідчить про належну температуру в автоклаві, а отже й надійність стерилізації. Для біологічного контролю стерилізації в автоклав вміщують спеціальні біотести – смужки фільтрувального паперу, марлі тощо, на яких знаходяться спори бактерій з відомою термостійкістю, спори відомої чисельності та ін.

Вони розкладаються в біксах, які підлягають стерилізації. Після завершення циклу в пробірки з смужками заливають живильне середовище та інкубують при оптимальній температурі. Відсутність проростання спор бактерій свідчить про ефективну стерилізацію.

У таблиці 4 наведено основні способи стерилізації різних медичних об’єктів.

 

Спори бактерій, які найчастіше використовують як індикатори

 

 

Способи стерилізації медичних об’єктів

Описание: Описание: Описание: Описание: R_12_contr_steriliz

Контролі стерилізації

 

Дезінфекція. Дезінфекція – це сукупність заходів для повного, часткового або селективного знищення потенційно патогенних для людини збудників на різних об’єктах довкілля з метою попередження передачі збудника від джерела інфекції до сприйнятливого організму.

Оскільки мікроорганізми мають різну чутливість до дезінфікуючих засобів, виділяють чотири ступені дезінфекції: A, B, C, D. Дезінфекційні заходи ступеня A передбачають знищення аспорогенних форм мікробів, рикетсій, мікоплазм, най­простіших. Заходи ступеня B використовуються для ліквідації грибів, деяких вірусів, бактерій, що мають підвищену стійкість (стафілококи, мікобактерії). Боротьба із збудниками особливо небезпечних інфекцій (чуми, холери, висипного тифу, меліоїдозу, сапу) вимагає заходів ступеня С. Знищення спор мікроорганізмів і найпростіших – заходів ступеня D.

Заходи дезінфекції, що використовуються в клініках, мікробіологічних, вірусологічних та інших лабораторіях досить різноманітні. Їх умовно можна поділити на 2 групи: фізичні та хімічні.

До першої групи можна віднести спалювання використаного перев’язочного матеріалу, відходів, сміття, пропалювання в полум’ї пальника, дію сухого жару, автоклавування за різних режимів, використання ультразвуку. Ефективними заходами є кип’ятіння предметів особливо з поверхнево активними речовинами, дезінфекція повітря за допомогою ультрафіолетового опромінення. Постійно використовуються такі елементарні заходи, як вологе прибирання, миття, очищення, витріпування ковдр, простирадл тощо. Такі заходи хоча й не знищують мікроорганізмів, однак сприяють суттєвому зниженню їх популяцій на різних об’єктах.

Потужним комплексом дезінфекційних заходів виступають численні хімічні препарати – дезінфектанти. До них пред’являють певні вимоги: 1) протимікробний ефект широкого спектра дії; 2) висока розчинність у воді, здатність утворювати з водою або повітрям активні та стійкі суспензії, емульсії, аерозолі; 3) здатність не втрачати протимікробних властивостей при наявності в середовищі органічних домішок; 4) низька токсичність; 5) відсутність алергізуючої дії; 6) відсутність пошкоджуючого ефекту щодо предметів, які ними обробляються; 7) доступність сировини, з якої виготовляються дезінфектанти, її дешевизна тощо.

Існує декілька сотень дезінфікуючих засобів різних груп. Серед них алкоголі, альдегіди, четвертинно-амонієві сполуки. Найширше використання знай­шли хлоромісткі препарати. До них належать 0,2-1,0 % хлорне вапно, яке виготовляють ex tempore з 10 % освітлених розчинів цієї речовини; 0,2-1,0 % розчини хлораміну В або Т; 5 % водні розчини гіпохлориду кальцію; 0,05-0,1 % розчин трихлоізоцианурової кислоти (диконіту); 0,1-0,2 % розчин сульфохлорантину. Окислювачі представлені 1-10 % розчином перекису водню, фенолами та їх похідними – 3-5 % розчинами лізолу, карболової кислоти, фенолу. До групи препаратів із солей важких металів належать мертиолят натрію, сулема. Широке застосування набули 2-3 % розчин формальдегіду, 3-10 % розчин крезолу та інші. Використовуються в практиці й газоподібні дезінфектанти – 40 % водний розчин формальдегіду, суміші окису етилену з вуглекислим газом (1:10) і окису етилену з бромідметилом (1:1).

На практиці виділяють поточну та заключну дезінфекцію. Поточну дезінфекцію проводять для зменшення мікробної контамінації у вогнищах інфекції. Їй підлягають ліжка, постільна і натільна білизна, рушники, матраци, подушки, меблі, килими, посуд, інструменти, прилади, що знаходяться на поверхні різних об’єктів, повітря, виділення, стічні води тощо.

Зокрема, поверхні столів, вікон, стелі, стіни, меблі дезінфікують протиранням і миттям з допомогою дезінфікуючих розчинів, постільну та іншу білизну перуть у цих розчинах. Ліжка, матраци, подушки обробляють у спеціальних камерах термохімічними методами, м’які меблі – за допомогою спеціальних аерозолів, посуд – зануренням у дезінфікуючі розчини. Обробка виділень і стічних вод проводиться термічними і хімічними методами. Повітря приміщень можна дезінфікувати пропусканням через спеціальні антибактеріальні фільтри, як це роблять в палатах гнотобіологічної ізоляції, або опромінюючи його ультрафіолетовими променями. Медичні інструменти, прилади спочатку очищають, дезінфікують, а потім, у разі потреби, стерилізують відомими способами.

Заключна дезінфекція проводиться з метою знищення збудників інфекційних захворювань у приміщенні, де перебував інфекційний хворий, і предметах, з якими він був у контакті. Така ситуація складається після виписування його з інфекційного стаціонару, переводу із соматичного відділення в інфекційне тощо.

Для забезпечення догляду за проведенням дезінфікуючих заходів розроблену спеціальну систему контрою. Вона включає в себе: а) зовнішній і внутрішній контроль відділами дезінфекції санітарно-епідеміологічних станцій та лабораторій лікувально-профілактичних закладів, який здійснюється візуальним, бактеріологічним, біологічним, хімічним та іншими методами; б) бактеріологічний контроль проводять, виявляючи у вогнищах інфекції індикаторних бактерій: при кишкових захворюваннях – кишкові палички, при крапельних інфекціях, туберкульозі – стафілококи, у лікувально-профілактичних закладах – умовно-патогенні мікроорганізми; контроль здійснюється 1 раз у місяць – один раз у квартал залежно від рангу лабораторії; в) забір контрольних проб (10-30 штук) проводять не раніше, ніж через 30-45 хвилин після закінчення дезінфекції; площа змивів не повинна бути меншою, ніж 200 см2; г) змиви беруть стерильними ватними тампонами і засівають на живильні середовища з дотриманням всіх правил асептики з метою запо­­бігання контамінації сторонньою флорою; для виділення бактерій групи киш­кової палички і золотистих стафілококів користуються спеціальними наборами ­живильних середовищ і схемами ідентифікації, визначених відповідними ­інструкціями.

Дезінфікуючі заходи вважаються ефективними, якщо у пробах не визначаються бактерії групи кишкової палички, умовно-патогенні мікроби, золотисті стафілококи

ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ І ВІРУСІВ. Основи біотехнології та генної інженерії

Генетика бактерій та вірусів - наука, що вивчає механізми успадковування генетичних ознак та їх фенотипні прояви.

   Вона започаткована блискучими експериментами Грегора Менделя в 60-х роках минулого століття. Закони Менделя були підтверджені дослідами Г. де Фріза, К. Клорренса, Е. Чермака. Значний вклад у розвиток вчення про мінливість мікроорганізмів внесли К. Негелі (засновник теорії плеоморфізму - про безмежну мінливість бактерій), Р. Кох і Ф. Кон, які висунули ідеї мономорфізму, що стверджували постійність та незмінність бактерійних ознак, притаманних певним видам.
   Значний внесок у вивчення законів мінливості мікроорганізмів зробили Л. Пастер, І. Мечніков, Л. Ценковський, М. Вавілов, М. Тимофєєв-Ресоцький. У 1944 р. О. Ейвері, К. Маклауд, М. Мак-Карті довели, що саме ДНК є речовиною, яка зберігає генетичну інформацію. Д. Уотсон і Ф. Крик, М. Уілкінсон у 1953 р. розшифрували генетичний код, встановивши особливості механізмів синтезу білка.

 

 

Описание: Watson

 

F. Crick i  J. Watson – відкривачі структури ДНК

 

 

 

Історія розвитку молекулярної біотехнології

Рік

Подія

1917

Карл Ереки ввів термін “біотехнологіяі”

1944

Евері, МакЛеод, МакКарті довели, що генетичним матеріалом є ДНК

1953

Уотсон і Крик розшифрували структуру ДНК

1970

Виділена перша рестриктуюча ендонуклеаза

1973

Бойєр, Коен заклали основи технології рекомбінантних ДНК (гібрид фагу λ і E. coli)

1978

Отримано перший людський інсулін

1982

Перша вакцина для тварин

1988

Створено метод ПЛР

1990

Почато роботу над проектом “Геном людини”

1996

Продаж першого рекомбінантного білка еритропоетину перевищив 1 млрд доларів США

1996

Визначено генетичну послідовність всіх хромосом еукаріотичного організму Saccharomyces srevisiae

1997

Клоновано савця із соматичної клітини

 

 

Організація генетичного матеріалу бактерії

   Як відомо, генетичний апарат прокаріотів побудовано з двоспіральної нитки ДНК, яка складається з 3х109 пар нуклеотидів і замкнута в кільце. Вона суперспіралізована завдяки поліамінам (сперміну, спермідину), іонам магнію і на електронних мікрофотографіях має форму намиста.

 

Описание: Рисунок2

Описание: Chro+pla
   ДНК E. coli

 

 

ДНК складається з пуринових (аденін, гуанін) та піримідинових (тимін, цитозин) нуклеїнових основ - гетероциклічних азотистих сполук, до складу яких входить цукор дезоксирибоза.

Описание: DNA

Будова ДНК

 

З’єднує полімери фосфорна кислота. Між ланцюгами існують ковалентні та водневі зв’язки, тому молекули легко розпадаються. Кількість аденінових основ дорівнює тиміновим, а гуанінових - цитозиновим.

 
   Хромосома у функціональному відношенні поділяється на фрагменти, які називаються генами. Ген - елементарна одиниця спадковості, що контролює синтез специфічного поліпептидного ланцюга (структурний ген) або діяльність структурних генів (ген-регулятор, ген-оператор). Представлено його невеликими ділянками геномної або епісомної ДНК. Кожний ген складається з триплетів (кодонів) нуклеїнових основ, які кодують одну амінокислоту.

   Гени, які відповідають за синтез сполуки, позначають рядковими літерами латинського алфавіту, які відповідають назві сполуки. Наприклад, his+ - гістидиновий ген, leu+ - лейциновий ген. Гени, що контролюють резистентність до антибіотиків, інших препаратів, позначаються літерою r (resistance - стійкість). Чутливі до препаратів бактерії позначаються літерою s (sensitive - чутливий). За цим принципом позначення kanr, risr означає резистентні до канаміцину та ристоміцину штами, а kans, riss - чутливі. Фенотип батерій позначається аналогічно генотипу, однак прописними літерами.

   Сукупність генів нуклеоїда та позахромосомних факторів спадковості зумовлюють генотип бактеріальної клітини. Фенотип - індивідуальний вияв генотипу в конкретних умовах існування.


   Існує певний механізм, за допомогою якого послідовність нуклеотидів у гені визначає послідовність амінокислот у білку.

   Спочатку ДНК клітини деспіралізується, і на одній із її ниток, як на матриці, фермент ДНК-залежна РНК-полімераза за принципом комплементарності формує полірибонуклеотидний ланцюг, який називається інформаційною або матричною РНК (іРНК, мРНК). Ця стадія синтезу білка називається транскрипція (transcriptio - переписую). 

  Інформаційна РНК переноситься клітиною в цитоплазму, де розташовані рибосоми. Розпочинаєтся наступний етап - трансляція (translatio - перенесення). Саме в цей період на рибосомах відбувається зчитування генетичного коду іРНК та побудова поліпептидних ланцюгів.

   У цитоплазмі клітини завжди існують особливі специфічні нуклеїнові кислоти, які називаються транспортними РНК (тРНК). На одному з кінців вони мають триплет нуклеотидів (антикодон), а на іншому - місце для з’єднання з відповідною амінокислотою (кодон). Вони доставляють необхідну амінокислоту до рибосоми, на якій відбувається елонгація (elongatio - подовження) поліпептидного ланцюга.

   Генетична інформація клітини може бути закодована як хромосомними генами, так і генами, які знаходяться у позахромосомному стані, тобто відмежовані від хромосоми, але здатні до тривалого підтримання та відтворення в такій формі. Їх виявлено у бактерій багатьох родів. Позахромосомні елементи спадковості представлено плазмідами, транспозонами, Is-елементами та фагами.

   

Найдрібнішими за своїми розмірами є Is-послідовності (insertion sequenses - вставлені послідовності).

Описание: image010

Вони складаються з 1000 пар нуклеотидів і не несуть інших генів, крім генів, що відповідають за їх переміщення у різні ділянки бактеріальної ДНК. В усіх випадках вони повязані з хромосомною або плазмідною нуклеїновою кислотою і не здатні до самостійної реплікації.

Функції:

*    Координуюча: взаємодія транспозонів, плазмід, помірних фагів між собою та хромосомою бактерії, забезпечуючи їх реплікацію.

*    2. Регуляторна: викликають інактивацію генів, або служать промоторами (ділянки ДНК, які регулюють експресію клітинних генів).

*    3. Індукують мутації за типом делеції або інверсії

   Транспозони (transposition - переміщення) є нуклеотидними послідовностями, які крім генів, що відповідають за транспозицію, можуть нести гени, кодуючі інші функції. Довжина їх сягає 2000-20000 нуклеотидних основ.

 

 Вони можуть існувати самостійно у вигляді кільцевої молекули ДНК, не здатної до реплікації, або бути включеними до складу бактерійних геномів і плазмід. Вони можуть нести інформацію про синтез, наприклад, бактеріальних ентеротоксинів, ферментів, руйнуючих антибіотики.
   Транспозони виявлено у клітинах дріжджів, бактерій, рослин, комах, хребетних і навіть людей. Найважливіша їх властивість - здатність до міграції з одного реплікона до іншого. За рахунок цього вони виконують
функції:

*    1. Регуляторна.

*    2. Кодуюча.

*    3. Індукують генні мутації за типом делеції або інверсії.

*    4. Включення їх в реплікон супро-воджується абераціями (структурними перебудовами) в ДНК цих репліконів; найчастіше проявляються інсерції, делеції, інверсії

Плазміди - кільцеві молекули ДНК молекулярною масою до 106-108 Д з 1,5-400 тис пар основ. Вони можуть існувати в цитоплазмі у вільному стані або бути інтегрованими з клітинною хромосомою. Тоді їх називають епісомами. Плазміди містять у своєму складі tra-оперон (transfer - перенос), який забезпечує їх здатність до передачі, і гени, які кодують якусь ознаку. Їх називають трансмісивними, якщо вони самостійно передаються іншим клітинам за допомогою кон’югації, і нетрансмісивними, коли не мають власного апарату передачі, а переносяться разом трансмісивними або при трансдукції. Вони можуть існувати в клітині у декількох копіях.
   

 

Види плазмід

*    1. Трансмісивні (конюгація).

*    2. Нетрансмісивні (трансдукція)

*    3. “Криптичні”.

*    4. Монокопійні

*    5.Мультикопійні

Плазміди виконують регуляторну та кодуючу функції. Регуляторний ефект їх полягає в здатності представляти власні реплікони при порушенні функціонування клітинних генів; кодуюча роль - у внесенні в клітину нових ознак, які надають їй певних переваг при взаємодії з організмом хазяїна.
    Сьогодні відомо декілька десятків різноманітних плазмід. Серед них найдетальніше вивчено плазміди F, Col, R, Ent, Hly, бактеріоциногенності, біодеградації. Плазміди F забезпечують перенос бактеріальної хромосоми при кон’югації. R-плазміди є факторами множинної резистентності до лікарських засобів. Вони кодують стійкість до 10 антибіотиків та солей важких металів (Ni, Cu, Hg). Col-плазміди забезпечують синтез коліцинів - білків з летальною активністю проти коліформних мікроорганізмів. Hly-плазміди зумовлюють утворення гемолізинів у золотистих стафілококів, Ent-плазміди забезпечують ентеротоксигенну активність штамів кишкової палички. Плазміди біодеградації надають мікроорганізмам здатність утилізувати незвичні субстрати: Cam-плазміда - камфору, Oct-плазміда - октану тощо.

Функціональні властивості плазмід

   

Про плазмідну локалізацію гена можуть свідчити високі темпи втрати ознаки спонтанно, а також підсилення її під впливом підвищеної температури, хімічних речовин (акридинові барвники), спільна втрата і спільне набуття декількох ознак.

   

Сприяти проявам мінливості бактерій можуть деякі помірні та дефектні бактеріофаги. За своїми біологічними властивостями вони подібні до плазмід, можуть самостійно

існувати в цитоплазмі бактеріальних клітин. При інтеграції з хромосомою мікроба вони можуть надавати йому нові ознаки.
   Таким чином, плазміди убіквітарні. Вони не мають вирішального значення для забезпечення існування бактерійних клітин, однак відіграють чи не найважливішу роль у створенні розмаїття генетичного матеріалу при природному відборі.

 

Мінливість мікроорганізмів

    Однією з основних ознак будь-якої живої структури є її мінливість. Не стали винятком в цьому плані численні представники мікробного царства.

   Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову або модифікаційну та спадкову або генотипну.
   Модифікаційна
мінливість полягає у зміні різноманітних властивостей мікроорганізмів під впливом факторів навколишнього середовища, однак вона не зачіпає генетичний апарат клітини спадково не передається. Вона зумовлюється адаптаційними механізмами бактеріальної клітини, її здатністю призвичаюватись до умов довкілля за рахунок активації генів, які перебувають у “німому” стані.

   Підлягають модифікаціям найрізноманітніші властивості бактерій. Досліджено зміни морфологічних ознак внаслідок старіння клітини, появу довгастих, зігнутих паличок вульгарного протею під впливом фенолу, зміну морфології холерного вібріона в результаті дії гліцерину. Під впливом пеніциліну, лізоциму, специфічних імунних сироваток грампозитивні та грамнегативні бактерії можуть втрачати свою клітинну стінку, перетворюючись у L-форми. Клітина при цьому втрачає свою типову морфологію, набуває кулястої форми, в ній можуть з’являтись дрібні зерна, вакуолі. Після припинення дії агента вони набувають звичного виду.

   Отже, модифікаційні зміни нетривалі, характеризують ступінь пристосування бактерій до нових умов існування, вони є нормою реакції клітини, засвідчуючи потенційну здатність генотипу реагувати на змінені умови існування.

   При генотипній мінливості мікроорганізмів різноманітні ознаки бактерій успадковуються та передаються нащадкам. Вона може розвиватись внаслідок мутацій та рекомбінацій.

 
   Мутаціями називають будь-які зміни послідовності нуклеотидів гена, що змінюють його структуру, а відповідно, й функціонування, але не пов’язані з рекомбінаційним процесом. Вважається, що мутаційний процес лежить в основі еволюції мікроорганізмів у природі. Послідовність нуклеотидів може змінитись або при заміні однієї пари основ на іншу внаслідок помилки під час реплікації або при розриві ДНК з наступним випадінням чи інверсією фрагменту, який лежить між точками розриву, або внаслідок вставки якогось нового фрагменту.

 
   Класифікувати мутації можна з різних точок зору. За своїм проявом їх можна поділити на морфологічні, фізіологічні, біохімічні та інші залежно від виду ознаки, яка змінилась внаслідок мутації. Серед морфологічних ознак може змінитись забарвлення або характер колонії бактерій. Інша група - це мутації стійкості. Після них мікроорганізм набуває здатності, наприклад, переносити токсичні концентрації речовин, які пригнічують ріст диких штамів (резистентність до антибіотиків). До біохімічних мутацій належать прояви ауксотрофності та прототрофності.

 
   За своїм походженням мутації поділяють на спонтанні та індуковані. Спонтанні мутації відбуваються з частотою 105-1012 без втручання експериментатора, за, нібито, оптимальних умов існування мікробів. Вони виникають внаслідок дії якихось не встановлених навколишніх факторів.

   Індуковані мутації виникають під впливом дії на клітину встановлених мутагенних факторів. Частота їх на декілька порядків вища, ніж спонтанних.

   За локалізацією мутації подіяють на нуклеоїдні, які виникають в нуклеоїді клітини, та цитоплазматичні, що виникають у позахромосомних елементах спадковості - плазмідах; за кількістю генів, які мутували, - на генні та хромосомні, за величиною - на великі (хромосомні) та малі (точкові).

   Хромосомні мутації частіше бувають інверсіями (фрагмент ДНК в молекулі перевертається на 180°), дуплікаціями (подвоєння ділянки хромосоми), делеціями (випадіння частини хромосоми), дислокаціями (відбувається зміна локалізації ділянки ДНК).

   Точкові мутації частіше спостерігаються як делеція, вставка фрагменту ДНК (інсерція) або заміна основ. Якщо спостерігають заміну пуринових основ на пуринові, а піримідинових на піримідинові, таку мутацію називають транзицією. За умови заміни пуринової основи на піримідинову і навпаки, мутація називається трансверсією.

 
   Будь-яка мутація, що змінює генотип дикого штаму, називається прямою мутацією. Якщо внаслідок мутації відновлюється вихідний генотип дикого штаму, вона називається зворотньою. Однак, коли відновлюється фенотип дикого штаму, але мутація відбувається в локусі, не зачепленому прямою мутацією, такий тип змін одержав назву супресорної мутації. Вона може бути внутрішньогенною та позагенною. Плейотропними називають такі мутації, які ведуть до зміни двох і більше ознак.

Мутації є ще таких видів:

*    1. Пряма мутація

*    2. Зворотна (обернена) мутація або реверсія

*    3. Супресорна мутація (внутріш-ньогення, позагенна). Веде до відновлення фенотипу а не генотипу.

*    4. Плейотропна мутація (зміна 2-ох і більше властивостей клітини)

*    5. Нонсенс-мутація (робить кодон нісенітним – не кодує жодної амінокислоти)   

   Збільшувати частоту мутаційного процесу можуть особливі фактори, які називають мутагенами. Найдоступніший мутаген - ультрафіолетове випромінювання з довжиною хвилі 2600 А°. Воно викликає особливі пошкодження - утворення димерів тиміну та заміну основ. Іонізуюче опромінення (рентгенівські промені, γ-промені) також спричиняє мутації різної природи. Велику групу складають хімічні мутагени. Найбезпечніший з них - азотиста кислота, яка дезамінує аденін. N-нітрозометилсечовина є супермутагеном й канцерогеном, здатним викликати різні типи мутацій. Не поступаються їй за своєю активністю нітрозогуанідин, етилметансульфонат. Високу мутагенну активність мають акридини, аналоги основ (5-бромурацил), які включаються до складу ДНК між основами, викликаючи зсув рамки зчитування. До біологічних мутагенів належить перекис водню, що утворюється при метаболізмі всередині клітин, лікарські препарати, такі як нітрофурани, деякі антибіотики (мітоміцин С).   

 

Класифікація мутагенів

*    Фізичні:

*    1. УФО (λ-2600 А) – найсильніша мутагенна дія; утворюються димери тиміну, заміна основ

*    2. Іонізуюче опромінення (рентгенівське, гамма-промені)

*    Хімічні:

*     1. Азотиста кислота (самий доступний і безпечний)

*     2. N-нітрозометилсечовина – супермутаген, канцероген

*     3. Етилметансульфонат

*     4. Акридини

*     5. Нітрозогуанідин

*     6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-амінопурин)

*     7. Лікарські препарати (нітрофурани, деякі антибіотики

*    Біологічні: перекис водню віруси, фаги

Дія різних мутагенів на бактерії

Своєрідною формою генотипної мінливості бактерій є явище дисоціації. Його можна спостерігати при культивуванні мікроорганізмів на щільних живильних середовищах. Ізольовані колонії мікроорганізмів певного виду утворюють на поверхні середовища колонії двох типів - S-форми (smooth - гладенький) і R-форми (rough - шорсткий). Колонії першого типу - гладенькі, блискучі, з рівними краями. Колонії R-типу, навпаки, мутні, шорсткі, з нерівним зазубреним краєм. Виявилось, що деякі властивості мікроорганізмів, незважаючи на те, що вони належать до одного й того ж виду, також відрізняються. Так, клітини S-форми колоній, нормальної морфології, викликають дифузне помутніння бульйону, біохімічно вони більш активні, повноцінні в антигенному відношенні, більш вірулентні, їх виділяють, як правило, в гострому періоді захворювання. Збудники чутливі до бактеріофагів і стійкі до фагоцитів, бактрицидної дії сироватки крові.
   Мікроорганізми, що утворюють R-форми колоній, мають слабшу біохімічну активність, менш чутливі до дії бактеріофагів і мають менш виражені вірулентні властивості. Винятком є збудники туберкульозу, сибірки, чуми.
   Дослідження довели, що такі зміни відбуваються внаслідок мутацій у генах, що детермінують синтез окремих компонентів мембран бактерій.

   Вважається, що дисоціація надає мікробам певних селективних переваг при існуванні в організмі хазяїна, і в той же час вона утруднює діагностику інфекційних хвороб, насамперед, дизентерії та ешерихіозів.

R і S форми колоній

Описание: Рисунок4Описание: Рисунок5Описание: Рисунок6

 

Властивості мікробів S-колоній

*    Клітини нормальної морфології

*    Дифузне помутніння бульйону

*    У рухомих видів є джгутики

*    У капсульних варіантів є капсули

*    Біохімічно більш активні

*    Повноцінні в антигенному відношенні

*    У патогенних видів – вірулентні

*    Виділяються в гострому періоді хвороби

*    Чутливі   до бактеріофагів

*    Менш чутливі до фагоцитозу

Однак протягом своєї еволюції бактерійні клітини виробили певні механізми, що забезпечують стабільність генетичного коду, оберігають його від мутацій або ліквідують їх негативні наслідки. Вони називаються репараціями. Репаративні процеси поширені у мікробів і контролюються за допомогою спеціальних генів.

 
   Виділяють види репарацій: фотореактивація
, темнова та SOS-реактивація.

Фотореактивація захищає клітину від негативної дії ультрафіолетової радіації, яка викликає утворення тимінових димерів. На сонячному світлі (λ - 300-400 нм) утворюються особливі ферменти, які руйнують зв’язки між піримідиновими димерами.

Феномен темнової репарації складніший за попередній. Його сутність полягає в тому, що особливі ферменти знаходять мутовану ділянку ДНК і вирізають її. За допомогою ДНК-залежної ДНК-полімерази комплементарно відновлюється вихідна структура молекули, і ферменти лігази зшивають її з материнською ниткою.

Для одержання мутантів розроблено методи, засновані на виявленні різниці в швидкості росту бактерій, різної здатності їх до виживання тощо.

SOS-реактивація

*    При множинних ушкодженнях ділянки з мутаціями переводяться в неактивний стан, а їх роль виконує неушкоджена ділянка ДНК

 

Методи виявлення мутантів

*    За різницею в швидкості росту (посів на мінімальне середовище; Мутанти виростають)

*    Різна здатність до виживання

*    Метод реплік Ледерберг

 

Найчастіше використовують метод реплік Ледербергів. Для цього чисту культуру бактерій, на яку діяв мутагенний фактор, засівають на повноцінне щільне живильне середовище з розрахунку, щоб виросло 100-200 ізольованих колоній. Після цього за допомогою штампа-реплікатора, вкритого оксамитом, діаметром дещо меншим за чашку Петрі колонії переносять на мінімальне живильне середовище.

Метод реплік для виявлення ауксотрофних мутантів

На ньому виростають тільки колонії прототрофних організмів. Порівнюючи їх розташування з вихідною материнською чашкою, знаходять колонії, утворені бактеріями-мутантами. Їх відсівають на живильні середовища для одержання чистої культури і вивчають морфологічні, культуральні, антигенні, біохімічні, біологічні та інші властивості.

 
   

 

Генетичні рекомбінації

    Рекомбінації - особливі феномени спадкової мінливості мікроорганізмів, які не пов’язані з мутаційним процесом. Рекомбінанти, що при цьому виникають, успадковують деякі ознаки обох “батьківських” клітин, адже відбувається експресія гена реципієнта та частини генома донора. Генетичні рекомбінації створюють невичерпне джерело різноманітних комбінацій генів, які природа використовує в процесі еволюції. Вважається, що здатність клітин до рекомбінацій детермінується особливими rec-генами (recombination - рекомбінація).

 
   Виділяють три основні види генетичних рекомбінацій: трансформація, трансдукція та кон’югація.

 
   Трансформація - процес гібридизації внаслідок переносу генетичних детермінант від бактерії бо бактерії за допомогою ізольованої ДНК.

   Вперше на явище трансформації звернув увагу Ф. Гриффітс у 1928 р., вивчаючи пневмококи (Streptococcus pneumoniae), які утворюють капсулу в організмі, а на агарі ростуть у вигляді гладеньких (S-форма) колоній. При введенні білим мишам вбитих нагріванням вірулентних капсульних пневмококів ІІІ типу разом з авірулентними бескапсульними пневмококами ІІ типу (R-форма) лабораторна тварина через декілька днів гинула, а з її крові висівались живі капсульні пневмококи ІІ серотипу. Отже, відбувалася глибока перебудова генетичного апарата клітини, яка набувала здатності синтезувати капсулу.

 

Дослід Ф. Гриффітс

 

 

 

Це означає, що авірулентний штам перетворився у вірулентний, що з мертвих клітин виділився якийсь агент, який надавав можливість живим клітинам утворювати полісахарид капсули. І ця ознака передавалась спадково.

 
   У 1944 р. О. Евері, К. Маклеод та М. Маккарті змоделювали цей феномен in vitro, виділили та очистили трансформуючий агент. Ним виявилась молекула ДНК. Трансформація відбувається тільки в тих клітинах, які здатні до неї. Такий стан визначається поняттям компетентності, природа якої остаточно не з’ясована. Вважається, що вона зумовлюється наявністю особливого білка - компонента клітинної мембрани, здатного розщеплювати деякі структурні елементи клітинної поверхні. Таким чином вивільняються рецепторні ділянки, з якими взаємодіє ДНК. Стан компетентності формується на певних стадіях розвитку бактеріальної клітини.
   Механізм явища трансформації полягає в тому, що спочатку на поверхні клітини-реципієнта адсорбується невеликий фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 частина хромосоми клітини-донора). Згодом він проникає всередину клітини, де одна нитка ДНК перетравлюється ендонуклеазами, а інша - вмонтовується у клітинну хромосому. Настає остання фаза процесу - експресія рекомбінантів. Такий процес інтеграції відбувається дуже швидко. Досліджено, що для появи рекомбінантів достатньо п’яти-десятихвилинного контакту клітини-реципієнта з донорською ДНК, а сам процес завершується через 2 год.

 

 

 

Трансформуючу активність ДНК можна призупинити хімічними мутагенами, ультрафіолетовим, іонізуючим опроміненням і, особливо, ферментом ДНК-азою, що переконливо свідчить про участь ДНК у цьому процесі.

 
   Здатність до трансформації виявлено у багатьох мікроорганізмів - представників родів Bacillus, Neisseria, Haemophilus, Staphylococcus, Escherichia та інших. За її допомогою можна передати резистентність до антибіотиків, здатність метаболізувати різноманітні речовини, капсулоутворення тощо. Феномен трансформації можна використати для аналізу спадкування певних ознак бактерійною клітиною, одержання шляхом гібридизації мікроорганізмів з новими властивостями.
   При кон’югації внаслідок фізичного контакту між бактеріями-донорами та бактеріями-реципієнтами відбувається передача генетичного матеріалу через особливі вирости, які називаються секс-пілі.

Описание: Conju



Вперше це явище дослідили Д. Ледерберг та E. Тейтум на моделі кишкової палички (1946). Необхідною умовою для процесу кон’югації є наявність в клітині-донорі особливого фактору, який називається F-фактор (fertility - плодючість). Він є кон’югативною плазмідою, що існує автономно в цитоплазмі бактерії. Складається вона з генів переносу та генів, що кодують певні ознаки клітини. Бактерії з F-факторами позначаються як F+-, а без нього - F-- клітини. F-фактор детермінує утворення статевих ворсинок, отже, здатність клітин до кон’югації. Статеві ворсинки - особливі трубчасті вирости на поверхні клітини. Вони порожнисті, довжина їх у декілька разів перевищує величину бактерії.


   Процес кон’югації починається з того, що за допомогою статевих ворсинок клітина-донор торкається клітини-реципієнта, фіксує її та притягує до себе. Після цього плазміда починає реплікуватись, і одна її нитка передається в реципієнтний штам, а інша залишається на місті. Відбувається комплементарний синтез іншої нитки ДНК. Таким чином, F+-фактор мають вже дві бактерії. Клітина, яка отримала кон’югативну плазміду F, набуває здатності синтезувати статеві ворсинки на поверхні, отже, може сама вступати в кон’югацію. Частота цього процесу - 10-6-10-8. В деяких випадках F-плазміда здатна інтегрувати з хромосомою. Якщо така інтеграція стабільна, утворюється клон клітин, в якому всі бактерії здатні вступати в кон’югацію з досить високою частотою - 10-1-10-4. Такий штам називають штамом Hfr (high frequency of recombination - висока частота рекомбінацій). На відміну від F+-клітин в Hfr-донорах F-фактор інтегрований з хромосомою бактерій. Коли такі клітини вступають в кон’югацію з F--штамами, до них передається тільки одна нитка ДНК. Триває процес 60-90 хвилин, а швидкість переносу становить до 5х104 пар нуклеїнових основ за одну хвилину. Таким чином, в клітині-реципієнті експресується власний геном та частина генома донора.

 Деколи в клітинах Hfr може відбуватись відщеплення F-фактора і він переходить в автономне існування в цитоплазмі, захопивши з собою сегменти хромосоми клітини-господаря. Такий F-фактор називається F-генота, а клітина, що його несе, клітиною F. В її хромосомі є дефект, відповідний втраченому фрагменту.

    Таким чином, від бактерії до бактерії можна перенести різноманітні властивості донорського штаму. Крім того, перериваючи процес кон’югації через певні проміжки часу і вивчаючи нові властивості, які набула клітина-реципієнт, можна визначити локалізацію генів на хромосомі, тобто провести її картування. 

Описание: map

 

   Явище кон’югації досліджено для багатьох представників мікробного царства - кишкових і синьогнійних паличок, сальмонел та інших. Встановлено, що процес кон’югації може відбуватись не тільки в межах одного виду, але й між різними родами бактерій. З медичної точки зору заслуговує на увагу факт передачі за допомогою кон’югації фактора множинної лікарської резистентності (R), який зумовлює стійкість бактерій до багатьох антибіотиків.


   Трансдукція
. У 1952 р. Н. Ціндер і Д. Ледерберг, вивчаючи процес кон’югації між різними штамами сальмонел, звернули увагу, що іноді обмін генетичним матеріалом відбувається не в результаті кон’югації, а внаслідок вивільнення з батьківських штамів помірного бактеріофага. Явище обміну генетичною інформацією у бактерій шляхом переносу фагами фрагментів ДНК від клітини-донора до клітини-реципієнта одержало назву трансдукції.

   Вона часто відбувається в ентеробактерій, псевдомонад, стафілококів та бацил. Вважають, що більшість видів мікроорганізмів несуть у своєму геномі профаг, тому трансдукція може бути надзвичайно поширеним явищем у мікробному світі.


   Виділяють три основні види трансдукції: специфічну, загальну або генералізовану та абортивну.

 

 Специфічна трансдукція характеризується здатністю бактеріофагів переносити лише певні гени від бактерії донора, які локалізуються по обидві сторони від місця інтеграції фага в геном клітини. Наприклад, фаг λ E. coli має сайт інтеграції в хромосому бактерій між генами gag i bio, які кодують відповідно ферментацію галактози й синтез біотину. При виході з бактеріальної хромосоми, він захоплює частку генетичного матеріалу донора (гени gag i bio), а сам при цьому втрачає частину власного генома. Такий бактеріофаг називають дефектним, тому що кількість власної ДНК обмежена за рахунок включення генома хазяїна. Бактеріофаг φ 80 переносить тільки триптофановий ген кишкових паличок.


   Клітини, які лізогенізовані дефектними фагами, стають несприйнятливими до зараження гомологічними вірулентними бактеріофагами.
   Під час формування головки бактеріофага і збирання фагових корпускул у нього може проникнути, отже, передатись бактерії-реципієнту, будь-який фрагмент ДНК бактерії-донора, наприклад, ген, що зумовлює резистентність до антибіотиків.

 
   Отже, фаг просто переносить генетичну інформацію, а його власна ДНК не бере участі в утворенні рекомбінантів.

   Процес трансдукції відрізняється від лізогенної конверсії, яку також забезпечують помірні бактеріофаги. При останній клітина набуває нових властивостей за рахунок експресії в ній власних генів фага. Яскравим прикладом такого явища є перенос tox+ генів дифтерійних фагів у дифтерійні палички, внаслідок чого вони набувають токсигенних властивостей. Аналогічне явище спостерігається у збудників ботулізму, стафілококів.

 
   При абортивній трансдукції фагова ДНК та гени бактерії-донора не інтегруються в хромосому реципієнта, а залишаються в цитоплазмі. Під час поділу клітини вони передаються тільки одній з дочірніх клітин, а згодом просто елімінуються з неї.

 
   Явище неспадкової та спадкової мінливості спостерігається також у вірусів. Модифікаціям підлягають склад білків капсиду, суперкапсиду, який зумовлюється впливом клітинних компонентів при репродукції віріонів.

 
   Як прояв генотипової мінливості, у вірусів виявлено також феномени мутацій та рекомбінацій. Внаслідок мутацій можуть змінюватись розміри бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність вірусів для тварин, чутливість їх до дії хіміотерапевтичних препаратів. Завдяки мутаціям, які виникли при пасажах вірусів через мозок кроликів, одержано фіксований вірус, а при пасажах через мозок курчат - штам Флюрі, які використовуються при створенні антирабічних вакцин для активної профілактики сказу. При зараженні чутливої клітини одночасно декількома вірусами спостерігаються прояви численних генетичних рекомбінацій: множинна реактивація, пересортування генів, крос-реактивація, гетерозиготність, транскапсидація. Вони зустрічаються також in vivо, що дозволяє по-новому оцінити деякі сторони розвитку вірусних інфекцій.

 

 

Практичне значення генетики бактерій

Генетичні феномени знайшли широке практичне застосування в різних галузях науки, техніки, медицини, фармацевтичної промисловості, біотехнології, сільського господарства.

   Завдяки застосуванню генетичних методів, одержано високоактивні штами бактерій, грибів, актиноміцетів, дріжджів, які продукували у 200-1000 разів і більше амінокислот, органічних кислот, ферментів, вітамінів, кормового білка, порівняно з вихідними, а також вакцинні штами мікроорганізмів та вірусів. Використання різноманітних мутагенів (ультрафіолетове та радіоактивне опромінення, хімічні речовини) дозволило створити мутантний штам гриба Penicillium chryzogenum, який у дикому стані продукував 100 од/мл пеніциліну, а після направленої селекції - 10000 од/мл

.
   Встановлено, що деякі мікроорганізми, наприклад, Fuzarium monilifore, синтезують біологічно активні субстанції типу фітогормонів, гіберелінів, біоінсектицидів та інших, які є ефективними стимуляторами росту й розвитку вищих рослин. Генетичні підходи дозволили проводити цілеспрямований селекційний процес для одержання продуцентів цих речовин

.
   Суттєвий вклад вносить генетика у зменшення забруднення довкілля: очистка стічних вод, переробка відходів і побічних продуктів сільськогосподарського виробництва та промисловості, запропонувавши спеціально селекціоновані з цією метою мікроорганізми.

   Стрімкий розвиток біологічної науки яскраво проявився у становленні генної та клітинної інженерії - сукупності експериментальних методів, за допомогою яких переносять гени від одного організму до іншого. Вона народилась у 1972 р., коли американським дослідникам П. Бергу, Г. Бойеру, С. Коену вдалось одержати гібрид вірусу мавпи SV-40 і бактеріофага λ.

    Ще донедавна можливість конструювання живих організмів із заданими властивостями здавалась недосяжною. Для здійснення цього фантастичного експерименту необхідно одержати відповідний ген, приєднати його до спеціального вектора - провідника, щоб не бути знищеним клітинними ферментами, ввести в іншу клітину і заставити там працювати. Для всіх цих операцій необхідна участь спеціальних ферментів (їх відомо вже декілька сотен), які здатні розрізати донорську ДНК і ДНК вектора в певних ділянках на окремі фрагменти. Інші ферменти необхідні для приєднання відповідних генів до ДНК. Для розшифровування будови генів використовують методи біохімічного синтезу за участю ферментів ревертаз. Як вектори використовують бактеріальні плазміди, бактеріофаги, деякі віруси. Вони здатні реплікуватись у клітині-реципієнті і містять один або декілька маркерів, що дозволяють розпізнавати рекомбінантні клітини.

 

 

 

Про високу ефективність генно-інженерних методів одержання хімічно чистих біологічно активних речовин свідчить такий факт. Щоб одержати 5 мг соматотропіну, було використано мозок 500 000 овець протягом 5 років, в той час як аналогічну кількість гормону дають 9 л бульйонної суспензії кишкової палички.


   Генна інженерія надала можливість одержати інсулін, простагландини, енкефаліни, інтерферон, інтерлейкіни, гормони, різноманітні ферменти, численні хімічно чисті вуглеводи - глюкозу, ксиліт тощо.

Деякі гормони людини, які продукуються рекомбінантними мікроорганізмами

Білок

Назва речовини

Інсулін

Гумулін, Новолін

Соматостатин

Протропін, Гуматроп

Інтерферон альфа

Роферон, Велферон

Інтерферон гамма

Актимун

Інтерферон бета

Фрон, Бетасерон

Інтерлейкін-2

Пролейкін

Фактор некрозу пухлин

-

Еритропоетин

Прокріт, Епоген

Гранулоцит колонієстимулюючий фактор

Філграстин, Ньюпоген

Плазміноген активатор

Актиліз

 

Медична наука стоїть на порозі розробки методів генної хірургії. Наприклад, у людини деколи зустрічається вроджена недостатність ферменту гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (ГГФРТ). У такому випадку вона схильна до подагри, часто спостерігається біль у суглобах, розвивається нирково-кам’яна хвороба. Експерименти на тваринах переконливо довели, якщо вмонтувати ген, відповідальний за синтез цього ферменту, в ретровірус і ввести його у спинний мозок білих мишей, вони починають синтезувати ГГФРТ. Клонований з макрофагів людини ген фактору некрозу пухлин у кишковій паличці при введенні її білим мишам із саркомами викликає їх руйнування.

   Широкі перспективи відкриває генна інженерія на шляху створення високоефективних засобів специфічної профілактики інфекційних захворювань. Введення в геном кишкових паличок, вірусів вісповакцини, дріжджів деяких генів вірусів гепатиту В, ящура дозволили розробити субодиничні вакцини.

 

 

 

 

СФЕРИ ВИКОРИСТАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ

Таким чином, мікробіологічна наука дозволяє створити струнку систему взаємопов’язаних галузей біотехнології, які мають унікальну перевагу - вони засновані на функціонуванні природних систем, які підпорядковуються інтересам людини.

 

Video

 

ГЕНЕТИКА ВІРУСІВ

*    Способи збільшення інформації:

*    - дворазове зчитування одієї іРНК з інших ініціюючих кодонів

*    - зсув рамки трансляції

*    - сплайсинг  (вирізання інтронів)

*    - транскрипція з ділянок ДНК, що перекриваються

 

У вірусів можуть бути:

*    Модифікації (зміна складу білків капсиду, суперкапсиду під впливом клітин)

*    Мутації (розмір бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність для тварин, чутливість до дії хіміотерапевтичних агентів, ts-мутації – температурочутливі – вірус втрачає здатність розмножуватись при підвищених температурах

*    Рекомбінації

 

ВИДИ ГЕНЕТИЧНИХ РЕКОМБІНАЦІЙ У ВІРУСІВ

*               1. Рекомбінація: Обмін генами (міжгенна) та їх частинами (внутрішньогенна)

Схрещування близьких за властивостями вірусів при одночасному культивуванні.

Наприклад, віруси поліомієліту ( збільшена і зменшена  чутливість до гуанідіну, різна нейровірулентність), віруси грипу (різна нейровірулентність для мишей, але одна пневмотропність), гібридизація вірусів віспи кролика і  вірусу вісповакцини

*               2. Множинна реактивація: вірусна інфекція викликається при зараженні віріонами з пошкодженим геномом, оскільки функцію цього гену виконує вірус, у якого ген не пошкоджено. Нащадки – неушкоджені віруси

*               3.  Пересортування генів:  між вірусами, що мають сегментовані геноми (віруси грипу людини, кочок, свиней, буньявіруси, аренавіруси, реовіруси). Гібридні форми називають реасортанти.

 

*               4. Гетерозиготність: одночасній репродукції декількох віріонів, різних за спадковими властивостями, утворюються віріони, що містять певний геном одного із батьківських штамів і частину геному іншого вірусу (т.з. диплоїдні або поліплоїдні віруси). Таке об’єднання не спадкується, але дозволяє дати нащадків з різними властивостями.

*               Це віруси грипу, хвороби Ньюкасл

*               5. Транскапсидація: частина чужерідного генетичного матерілау, заключеного всередині капсиду іншого вірусу, здатна переноситься в стабільній формі в чутливі до основного вірусу клітини.

Аденовіруси людини не розмножуються в клітинах мавп. Але при одночасному культивуванні аденовірусів та вірусів SV-40 під одним капсидом утворюється вірус, що містить геноми обидвох вірусів, який здатний розмножуватись у клітинах мавп.

*               6. Крос-реактивація (рятування маркера): реактивація інактивованого геному неінактивованим (подібно до множинної реактивації)

 

 

ВИДИ НЕГЕНЕТИЧНОЇ ВЗАЄМОДІЇ ВІРУСІВ

*    1. Фенотипове змішування

*    2. Негенетична реактивація

*    3. Комплементація

*    4. Стимуляція

*    5. Інтерференція

 

 

  Фільм "Біотехнологія"

 

http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/video/med_bio/index.php?name_film=biot